SHH信号通路对MCAO模型大鼠脑缺血后的保护机制分析

许俊杰 王宝祥 朱东胜 胡进

[摘要] 目的 探讨人重组Shh蛋白（SHH）信号通路对大脑中动脉梗死（MCAO）模型大鼠脑缺血后的保护机制。 方法 SPF级SD大鼠36只随机分为假手术组、模型组和SHH组，每组各12只。大鼠MCAO模型制备采用线栓法制成，侧脑室注射外源性SHH蛋白激活SHH信号通路。神经功能依据Longa标准评分进行评价;采用TTC测定大鼠梗死体积;采用激光多普勒血流仪，记录左侧大脑中动脉供血区域血流变化值;实时荧光定量PCR法（RT-PCR）测定VEGF和Ang-1 mRNA表达;采用Western blot测定VEGF 和Ang-1蛋白表达。 结果 模型组和SHH组大鼠神经功能评分高于假手术组（P<0.05）;SHH组大鼠神经功能评分低于模型组（P<0.05）。模型组和SHH组大鼠梗死体积高于假手术组（P<0.05）;SHH组大鼠梗死体积低于模型组（P<0.05）。模型组和SHH组大鼠脑血流值低于假手术组（P<0.05）;SHH组大鼠脑血流值高于模型组（P<0.05）。模型组和SHH组大鼠VEGF和Ang-1相对表达量低于假手术组（P<0.05）;SHH组大鼠VEGF和Ang-1相对表达量高于模型组（P<0.05）。模型组和SHH组大鼠VEGF和Ang-1蛋白表达灰度值低于假手术组（P<0.05）;SHH组大鼠VEGF和Ang-1蛋白表达灰度值高于模型组（P<0.05）。 結论 SHH信号通路可改善MCAO大鼠神经功能，降低梗死体积，通过上调VEGF和Ang-1表达促进血管新生。

[关键词] 人重组Shh蛋白信号通路;大脑中动脉梗死;神经功能;梗死体积;脑血流;血管内皮生长因子;人血管生成素-1

[中图分类号] R743.3          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2022）10-0020-04

[Abstract] Objective To investigate the protective mechanism of human recombinant Shh protein （SHH） signal pathway on middle cerebral artery infarction （MCAO） model rats after cerebral ischemia. Methods A total of 36 SPF SD rats were randomly divided into the sham operation group， the model group and the SHH group， with 12 rats in each group. The MCAO rat model was prepared using the thread plug method. The SHH signal pathway was activated by injection of exogenous SHH protein into the lateral ventricle. Neural function was evaluated according to Longa standard score. Infarct volume was measured by TTC. Laser Doppler blood flow meter was used to record blood flow changes in the blood supply area of the left middle cerebral artery. Real-time fluorescent quantitative PCR （RT-PCR） was used to measure VEGF and Ang-1 mRNA expression. Western Blot was used to determine VEGF and Ang-1 protein expression. Results The neurological function scores in the model group and the SHH group were higher than that in the sham operation group （P<0.05）. The neurological function score in the SHH group was lower than that in the model group （P<0.05）. The infarct volumes in the model group and the SHH group were higher than that in the sham operation group （P<0.05）. The infarct volume in the SHH group was lower than that in the model group （P<0.05）.The cerebral blood flow values in the model group and the SHH group were lower than that in the sham operation group （P<0.05）. The cerebral blood flow value in the SHH group was higher than that in the model group （P<0.05）. The relative expression levels of VEGF and Ang-1 in the model group and the SHH group were lower than those in sham operation group（P<0.05）. The relative expression levels of VEGF and Ang-1 in SHH group were higher than those in the model group （P<0.05）.The gray values of VEGF and Ang-1 protein expression in the model group and the SHH group were lower than that in the sham operation group（P<0.05）. The gray value of VEGF and Ang-1 protein expression in the SHH group was higher than that in the model group（P<0.05）. Conclusion SHH signal pathway can improve nerve function， reduce infarct volume， and promote angiogenesis by up-regulating expression of VEGF and Ang-1 in MCAO rats.810809B7-C3AC-43E1-85FA-04ED8058FCD0

[Key words] Human recombinant Shh protein signal pathway; Middle cerebral artery infarction; Nerve function; Infarct volume; Cerebral blood flow; Vascular endothelial growth factor; Human angiopoietin-1

随着近年来人们生活水平的不断提高，脑血管疾病是一种危害人类健康的常见病，不仅给人们的生活质量造成严重影响，同时给患者造成痛苦[1]。其中缺血性卒中在脑血管疾病中占比很高，致残率和致死率较高，越来越受到临床医师重视[2]。目前，临床治疗缺血性卒中手段有限，缺乏对大脑可塑性和整体性的深刻认知。因此，探求缺血性卒中后新的诊断和治疗手段尤为关键。SHH信号通路主要是由SHH、下游转录因子和跨膜受体（SMO、PTCH）组成，研究发现其与脑血管疾病关系紧密[3]。本研究旨在探讨SHH信号通路对MCAO模型大鼠脑缺血后的保护机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

研究时间2019年1月至2021年1月，SPF级SD大鼠36只，雄性，体重200～240 g，室温（23±2）℃，湿度50%～60%，适应性饲养1周，自由饮水饮食。购自北京维通利华实验动物中心，动物许可证号：SCXK（京）2006-2009。

1.2 主要试剂

SHH蛋白（北京百奥莱博科技有限公司），VEGF抗体（北京百奥莱博科技有限公司），Ang-1抗体（北京百奥莱博科技有限公司），2.3.5三苯基氯化四氮唑溶液（TTC，美国Sigma公司），Trizol试剂盒（上海百研生物科技有限公司），蛋白提取试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司）。

1.3 MACO模型制备

采用线栓法制备模型[4]。具体方法：取颈部正中切口约2 cm，分离离心组织，将大鼠颈总动脉和迷走神经迅速暴露，分离大鼠颈外动脉和颈总动脉近心端且进行结扎，以上距颈总动脉分叉处2 mm左右剪一小口，将制作好的进口鱼线沿大鼠颈总动脉插入颈内动脉，至20 mm左右时对颈内动脉进行结扎。可根据动物体重选择栓性。假手术组插入约10 mm，其余同手术组。

1.4 实验分组和处理方法

随机分为假手术组、模型组和SHH组，每组各12只。假手术组和模型组注射等剂量PBS溶液;SHH组大鼠在模型制备成功后，向左侧侧脑室注射2 μl SHH蛋白。

1.5 观察指标

1.5.1 神经功能评分  于大鼠清醒后参照Longa标准[4]评分评价神经功能，分值0～4分，评分越高神经功能缺损越严重。

1.5.2 梗死体积测定  大鼠以10%水合氯醛（4.0 ml/kg）麻醉后，断头取脑，且将大鼠低位脑干、小脑、嗅球去除，自额极后2 mm作等距离A、B、C、D、E冠状切片，取C片后作TTC测定大鼠梗死体积。

1.5.3 脑血流值测定  采用多普勒血流仪测定左侧大脑中动脉供血区域血流變化值。

1.5.4 实时荧光定量PCR法（RT-PCR）测定VEGF和Ang-1 mRNA表达  取大鼠脑组织，按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA，每个样本取总RNA 1 μg逆转录合成cDNA。PCR反应条件：94℃ 120 s;94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 60 s，共40个循环;72℃ 10 min。引物由上海生物工程有限公司合成。VEGF 上游引物：5-AGAAGGAGGAGGGCAGAATCA-3，下游引物：5CAA-ATGCTTTCTCCGCTCTGA-3;Ang-1下游引物：5TT-GTGCTGGGTCTGGTTT-3，下游引物：5CTTGATGC-TGCCCTTGTT--3。采用2-△△Ct测定VEGF和Ang-1 miRNA相对表达量。

1.5.5 Western Blot测定VEGF和Ang-1蛋白表达  提取脑组织总蛋白，定量后SDS-PAGE分离目的蛋白，将其转移至PVEDF膜封闭2 h，加入MYBL2一抗（1：200）放置于4℃下过夜，加入二抗（1：500）放置于室温下孵育1 h，以β-actin作为内参，测定蛋白灰度值。

1.6 统计学方法

运用SPSS 26.0统计学软件处理数据，计量资料以（x±s）表示，两组间行t检验，多组间行方差分析;计数资料以[n（%）]表示，行χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较

大鼠神经功能评分，模型组为（2.47±0.39）分，SHH组为（0.65±0.17）分，均高于假手术组的（0.00±0.00）分（P<0.05）;SHH组大鼠神经功能评分低于模型组（P<0.05）。

2.2 各组大鼠梗死体积比较

大鼠梗死体积模型组（62.31±5.45）mm3，SHH组（22.18±3.26）mm3，均高于假手术组（0.00±0.00）mm3（P<0.05）;SHH组大鼠梗死体积低于模型组（P<0.05）。

2.3 各组大鼠脑血流值比较

模型组和SHH组大鼠脑血流值低于假手术组（P<0.05）;SHH组大鼠脑血流值高于模型组（P<0.05）。见表1。

2.4 各组大鼠VEGF和Ang-1 mRNA相对表达量比较

模型组和SHH组大鼠VEGF和Ang-1 mRNA相对表达量低于假手术组（P<0.05）;SHH组大鼠VEGF和Ang-1 mRNA相对表达量高于模型组（P<0.05）。见表2。810809B7-C3AC-43E1-85FA-04ED8058FCD0

2.5 各组大鼠VEGF和Ang-1蛋白表达比较

模型组和SHH组大鼠VEGF和Ang-1蛋白表达灰度值低于假手术组（P<0.05）;SHH组大鼠VEGF和Ang-1蛋白表达灰度值高于模型组（P<0.05）。见表3。

3 讨论

缺血性卒中病理机制较为复杂，炎症、细胞凋亡、氧化应激等均为关键因素[5-6]。目前，重组组织型纤溶酶激活酶为治疗缺血性卒中最有效的一种药物，但因其应用受时间窗限制，故而大多数发病后仍无法进行及时有效治疗[7]。因此，缺血性卒中后新的诊断和治疗手段尤为关键。SHH蛋白能够与PTCH结合形成PTCH/SMO复合物，并能释放有活性的SMO分子，其中SMO激活且促进下游转录因子GLI的表达[8]。研究发现，大鼠脑缺血模型急性期SHH蛋白能够短暂高表达，而外源性SHH蛋白能够保护受损神经细胞[9]。本研究表明，神经功能评分比较，SHH组大鼠低于模型组，由此可见SHH信号通路可改善大鼠神经功能;梗死体积比较，SHH组大鼠低于模型组，表明SHH信号通路能够使大鼠梗死体积降低;脑血流值比较，SHH组大鼠高于模型组，证实SHH信号通路能够改善大鼠脑血流。但本文存在局限之处，观察大鼠较少，缺乏多中心、多样本深入研究，还需后续深入研究，提供可靠参考价值。

缺血性卒中发生后形成新生血管具体机制较为复杂。有学者研究报道显示，缺血性脑卒中发生后，会激活血管新生有关的生长因子如Ang-1、VEGF等受体，活化且释放下游通路有关的酶，从而产生一系列变化[10-12]。缺血性脑卒中发生后，VEGF在促血管新生早期过程具有重要作用，并且VEGF与VEGFR2结合后，促进血管新生[13]。同时，Ang家族与VEGF家族作用互补，且Ang家族与VEGF家族可调节缺血性脑卒中后的血管新生[14-16]。Ang家族分子能够与VEGF家族共同促进缺血性脑卒中发生后的血管新生过程，其中Ang-1主要通过提高内皮细胞存活，以此能够参与促进新生血管的封闭和成熟[17-20]。本研究表明，SHH组大鼠VEGF和Ang-1相对表达量高于模型组，SHH组大鼠VEGF和Ang-1蛋白表达灰度值高于模型组，由此证实SHH信号通路可通过上调VEGF和Ang-1表达促进血管新生，笔者认为其原因可能是由于SHH信号通路在胚胎发育期通过激活Notch通路，以此促进血管新生;同时，SHH信号通路通过GLI途径、COUP-TFII途径及PI-3激酶途径促进新生血管变粗、变长、分叉和弯曲，形成直径较大的血管，从而增加血流供应。

综上所述，SHH信号通路可改善MCAO大鼠神经功能，降低梗死体积，通过上调VEGF和Ang-1表达促进血管新生。

[参考文献]

[1]   王光耀，荆京，孟霞，等.缺血性脑血管病梗死模式的分类及病因、发病机制研究进展[J].中国卒中杂志，2019， 14（9）：950-954.

[2]   余经盛，肖骋.神经介入联合阿替普酶静脉溶栓治疗急性缺血性脑卒中患者疗效及出血风险研究[J].创伤与急危重病医学，2021，9（2）：142-144.

[3]   刘美，邓萍萍，马勋泰.Shh信号通路在大脑皮质发育畸形发生发展中的作用机制研究进展[J].山东医药，2018， 58（31）：96-99.

[4]   Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in cats[J].Stroke，1989，20（1）：84-91.

[5]   李晗，王希明.基于多模态MRI评估缺血性脑卒中侧支循环的研究进展[J].中华放射学杂志，2021，55（4）：444-447.

[6]   Finnsdóttir H，Szegedi I，Oláh L，et al.The applications of transcranial Doppler in ischemic stroke[J].Ideggyogy Sz，2020，73（11）：367-378.

[7]   Du HW，Wilson D，Ambler G，Banerjee G，et al.Small vessel disease and ischemic stroke risk during anticoagulation for atrial fibrillation after cerebral ischemia[J].Stroke，2021，52（1）：91-99.

[8]   朱美霖，白宏英.調控Sonic Hedgehog信号通路对急性脑缺血大鼠血管再生影响的实验研究[J]. 陕西医学杂志，2020，49（7）：774-777.

[9]   王宝祥，戴若莲，李焰生.SHH对MCAO模型大鼠血管新生的影响及作用机制[J].山东医药，2015，3（14）：1-4.

[10]  孙云云，洪二春，张桁忠.血小板与淋巴细胞比值对阿替普酶静脉溶栓的急性缺血性脑卒中患者预后的预测价值[J].中华老年心脑血管病杂志，2021，23（6）：609-612.

[11]  马玉萍，闫晓洁，李晓华，等.持续应用血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素受体阻滞剂治疗缺血性脑卒中对rt-PA疗效的影响[J].中国老年学杂志，2021，41（7）：1369-1371.

[12]  伉奕，杨涌涛，马宇，等.TLR4抑制剂TAK-242预处理改善急性缺血性脑卒中诱导的肠黏膜屏障损伤[J].中国免疫学杂志，2021，37（2）：214-219.

[13]  张依，朱娅丽，严之红，等.老年缺血性脑卒中患者VEGF及IMD水平与卒中后认知功能的关系[J].标记免疫分析与临床，2020，27（11）：1873-1876，1885.

[14]  方丽萍，傅阳俊，彭俊，等.血管生成素-1与急性缺血性脑卒中患者预后的关系[J].中华神经医学杂志，2018， 17（10）：1041-1044.

[15]  侯玉梅，曾慧，张晨阳，等.基于数据挖掘的缺血性脑卒中患病风险预测[J].中国老年学杂志，2021，41（1）：177-181.

[16]  陈秀英，左旭政，程畅，等.血清SDF-1、Ang-1与急性缺血性脑卒中预后的关系及其预测价值[J].卒中与神经疾病，2020，27（2）：166-170，184.

[17]  胡珊，郑超，何欢.动脉内机械取栓治疗缺血性脑卒中的效果及其影响因素分析[J].中国当代医药，2021，28（21）：9-12.

[18]  叶曾艳.半夏白术天麻汤加减联合依达拉奉治疗急性缺血性脑卒中的临床应用价值[J].中国当代医药，2020， 27（25）：34-36.

[19]  王艳，兰坚，何顺学.血清血管内皮生长因子、Toll样受体与颈动脉支架成形术治疗急性缺血性脑卒中患者预后的相关性研究[J].实用医院临床杂志，2019，16（1）：30-32.

[20]  谢涛波，钟纯正，符尧天，等.丁苯酞联合阿司匹林肠溶片治疗对老年缺血性脑卒中患者神经功能及神经递质水平的影响[J].中国医药，2021，16（4）：554-557.

（收稿日期：2021-09-17）810809B7-C3AC-43E1-85FA-04ED8058FCD0