重组人血管内皮抑素增强EGFR-TKIs对肺癌的抗瘤作用

龙亚辉 周辉

[摘要] 目的 探討重组人血管内皮抑素联合表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）耐药细胞系H1975体外及对裸鼠移植瘤的抗瘤作用。方法 建立H1975肺癌细胞系裸鼠移植瘤模型24只，并随机分为对照组、单一用药组和联合用药组，每组各8只，建立H1975肺癌细胞系裸鼠移植瘤模型，对照组小鼠不做任何处理，单一用药组注射恩度，联合用药组注射厄洛替尼和恩度，2周后处死实验鼠，并将肿瘤取出进行测量，分析不同用药方法对裸鼠移植瘤的抗瘤作用。结果 随着给药时间的延长，对照组小鼠慢慢精神较差，活动量与饮食量减少，卷缩扎堆，毛色灰暗无光泽度。联合用药组小鼠活动情况与饮食情况基本正常，单一用药组小鼠表现介于两组之间;三组小鼠的肿瘤体积与重量比较，差异有统计学意义（P<0.001），对照组最大，其次为单一用药组，最后为联合用药组;小鼠肿瘤组织中MVD计数与VEGF表达比较，三组小鼠血管内皮细胞生长因子（VEGF）表达与微血管密度 （MVD）计数比较，差异有统计学意义（P<0.001），联合用药组的数值最小;两组不同治疗方法对小鼠体内H1975细胞和ECV细胞的抑制作用比较，联合用药组的抑制率明显优于单一用药组，差异有统计学意义（P<0.001）。结论 应用恩度与厄洛替尼联合作用于肺癌肿瘤，能够减小肿瘤大小，能够抵抗肿瘤，可以应用在EGFR-TKIs耐药患者中，值得临床推广。

[关键词] 重组人血管内皮抑素;EGFR-TKIs;耐药;肺癌

[中图分类号] R734.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2022）11-0016-04

[Abstract] Objective  To investigate the antitumor effect of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor （EGFR-TKIs） in combination with recombinant human vascular endostatin on xenograft tumor in nude mice in vitro using drug-resistant cell line H1975. Methods Twenty four nude mouse xenograft tumor models of the H1975 lung cancer cell line were established and randomly divided into the control group， the monotherapy group and the combination group， with 8 mice in each group. Mice in the control group were given no treatment. The monotherapy group was injected with endostar， and the combination group was injected with erlotinib and endostar. After 2 weeks， the mice were sacrificed， and the tumors were removed for measurement to analyze the anti-tumor effect of different medication methods on transplanted tumors in nude mice. Results  With the prolongation of administration time， the mice in the control group were in poor spirits gradually， with reduced activity and diet， and their hair color was dark without gloss. The activity and diet of mice in the combination group were basically normal， while those in the single group were between the two groups. Statistically significant differences were observed in the tumor volume and weight among the three groups， with the largest in the control group， followed by the monotherapy group， and the smallest in the combination group （P<0.05）. The comparison of MVD count and VEGF expression in tumor tissues of mice showed that the vascular endothelial growth factor （VEGF） expression and microvessel density （MVD） count were statistically significantly different among the three groups. The values were the least in the combination group， with statistically significant differences （P<0.001）. By comparing the inhibitory effects of different treatment methods on H1975 cells and ECV cells in mice， it was found that the inhibitory rate of the combination group was statistically significantly lower than that of the monotherapy group （P<0.001）. Conclusion  The combined action of endostar and erlotinib on lung cancer tumors can reduce the tumor size and resist the tumor， which can be applied in patients with drug resistance to EGFR-TKIs and is worthy of clinical promotion.37F02D83-6E2B-4E2E-8EBA-CB51506ADABE

[Key words] Recombinant human vascular endostatin; EGFR-TKIs; Drug resistance; Lung cancer

据相关专家统计，到2030年我国每年肺癌的发病人数会达到100万人，患者5年生存率只有10%左右[1]，其发病率居全球恶性肿瘤首位，也是我国发病率和死亡率均居第1位的恶性肿瘤。在当前肺癌的治疗中，应用表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKI5）效果确切，且不良反应小，成为敏感突变人群首选用药。但是随着药物使用，EGFR-TKIs会在6～12个月后出现耐药性[2-3]。相关研究表明[4-6]，重组人血管内皮抑素可抑制肿瘤学内皮细胞的迁移和增殖，从而抑制肿瘤形成新生血管，同时抑制血管内皮细胞增殖，对转移性肿瘤和原发性肿瘤的种植瘤均有显著的抑制作用且无明显毒副反应。相关研究表明，联合EGFR-TKI5和血管内皮细胞生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）抑制剂具有协同抗肿瘤作用。本文建立H1975肺癌细胞系裸鼠移植瘤模型24个，分析重组人血管内皮抑素增强EGFR-TKIs对肺癌的抗瘤作用，现报道如下。

1材料与方法

1.1材料来源

1.1.1实验动物  选择无特殊病原体、健康的C57BL/6小鼠，5～7周龄，共24只，实验动物许可证号SCXK（京）2005-0013，来自中国医学科学院实验动物研究所。应用动物实验室饲养环境系统进行养殖。在饲养8 d后体重增至16.6～22.2 g后应用于实验。

1.1.2免疫组织化学试剂  抗鼠CD34单克隆抗体、兔抗鼠VEGF单克隆抗体、小鼠VEGF试剂盒（ELISA）、正常羊血清、防脱片剂多聚赖氨酸、浓缩型DAB试剂盒、二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。RIPA蛋白抽提试剂盒及BCA蛋白定量试剂盒（北京赛驰生物科技公司）。携带L858R和T790M的人肺腺癌H1975细胞株（中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心）。

1.1.3主要设备  超纯水纯化系统（台湾艾柯公司）;H-7500透射电子显微镜（日立）;LEICA ASP300S全自动脱水机[德国徕卡（1eica）公司];形态学图像分析系统（Motic）;HEPA100型二氧化碳培养箱（美国热电公司）、台式离心机（Sigma公司）;4°C冰箱（中国海尔）;倒置相差显微镜（日本Olympus公司）;SW-CJ-2FD超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）。

1.2方法

1.2.1动物实验  将H1975细胞接种于96孔板中，5000个/孔，分3个处理组，每组设置8个复孔;实验第2天待细胞贴壁后应用药物进行处理，对照组小鼠应用DMSO处理，单一用药组应用恩度[山东先声麦得津生物制药有限公司，国药准字S20050088，规格：15 mg/（3 ml·支）]浓度为10 μg/ml，联合用药组小鼠应用10 μg/ml恩度联合4 μg/ml厄洛替尼[Roche Pharma（Switzerland）Ltd，国药准字H20090599，规格：100 mg/150 mg]处理。对所有组别小鼠行腹腔注射，每次0.2 ml，每日一次。两周实验结束后测量小鼠肿瘤的体积和重量。

1.2.2体外细胞培养  将H1975细胞在100 U/ml链霉素、100 U/ml青霉素和10%胎牛血清的DMEM培养基中进行常规培养，放置于5%CO2、37℃的培养箱之中进行培养，培养2 d后行一次传代，取对數生长细胞进行实验。

1.3 观察指标

①随着给药时间的延长，观察三组小鼠精神状态、活动量、饮食量及毛色情况;②三组小鼠肿瘤体积与重量分析：两周实验结束后处死小鼠，取接种部位肿瘤，称量体重，然后用游标卡尺测量肿瘤的最长径（a）和最小径（b），根据计算公式V=0.5 ab2计算肿瘤体积; ③三组小鼠肿瘤组织中MVD计数与VEGF表达：取三组小鼠的肿瘤组织的3张石蜡切片，在100倍显微镜下每张切片随机选取两个视野，先在光镜低倍镜（×100）下每张切片选取3个血管密度高的区域，再转到高倍镜（×200）下计数每一区域血管数量，以其平均值作为MVD计数;VEGF蛋白的表达从三组肿瘤组织的石蜡切片中随机选3张进行改良ABC免疫酶标记法检测，测定方法按照产品说明书进行操作。在100倍显微镜下每张切片随机选取两个视野，利用免疫组化定量分析软件进行图像分析，测定各组在统一光度下阳性细胞面积（Area）和光密度（ID）值，计算免疫组化指数（IA）。计算公式：IA=Area×ID×0.28;④两组不同治疗方法对H1975细胞和ECV细胞的抑制：瘤重抑制率（%）=（对照组平均瘤重-药物组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%。

1.4统计学方法

采用SPSS 23.0统计学软件进行数据分析，计数资料以[n（%）] 表示，采用χ2检验;符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用F检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1实验动物观察比较

随着给药时间的延长，对照组小鼠慢慢精神较差，活动量与饮食量减少，卷缩扎堆，毛色灰暗无光泽度（图1A）。联合用药组小鼠活动情况与饮食情况基本正常，单一用药组小鼠表现介于两组之间（图1B）。

2.2实验结束时三组肿瘤体积与重量比较

三组小鼠的肿瘤体积与重量比较，差异有统计学意义（P<0.001），对照组最大，其次为单一用药组，最后为联合用药组。见表1。37F02D83-6E2B-4E2E-8EBA-CB51506ADABE

2.3三组小鼠肿瘤组织中MVD计数与VEGF表达比较

三组小鼠VEGF表达与MVD计数比较，差异有统计学意义（P<0.001），联合用药组的数值最小。见表2。

2.4两组不同治疗方法对H1975细胞和ECV细胞的抑制作用比较

联合用药组的抑制率明显优于单一用药组，差异有统计学意义（P<0.001）。见表3。

3讨论

肺癌在全球范围内已成为癌症死亡的重要原因，其中有70%～80%的肺癌患者为非小细胞肺癌，在发现时已经失去了手术治疗机会[7]。所以需要应用免疫治疗、放化疗等综合治疗方法，但效果并不理想。因为肿瘤的生长需要血管的形成代谢废物、提供营养，肿瘤转移、浸润需要依赖血管生成，因此抗血管生成治疗成为肺癌治疗研究的热点。重组人血管内皮技术是针对于内皮细胞作为靶点的一种合成内皮抑素制剂。当前大量研究表明[8-10]，重组人血管内皮抑素具有抵抗肺癌的作用，这是因为重组人血管内皮抑素能够抑制肿瘤新生血管生成，并修剪不成熟血管，强化残留血管，能够让肿瘤组织出现短暂正常化时间窗，增加血流灌注效率，提高化疗效果，而且也能够减轻机体其他气管对化疗药物的负担。EGFR-TKIs是目前世界范围内肺癌治疗领域中应用最广泛的靶向药物。多数患者初期使用EGFR-TKIs治疗有效，但一段时期后会出现继发性耐药，最常见的机制是发生T790M突变[11-13]。因此本文对小鼠进行实验，联合应用重组人血管内皮抑素和EGFR-TKIs。

本研究结果显示，随着给药时间的延长，对照组小鼠慢慢精神较差，活动量与饮食量减少，卷缩扎堆，毛色灰暗无光泽度。联合用药组小鼠活动情况与饮食情况基本正常，單一用药组小鼠表现介于两组之间。旷华香等[14]研究表明，重组人血管内皮抑素不仅能够导致血管正常化作用，并修剪掉一些无功能和不成熟的血管，能够让更多的血流到达肿瘤内部，让药物更好地作用于肿瘤细胞。且能够抑制血管内皮细胞的生长，重组人血管内皮抑素和EGFR-TKIs联合使用效果更好，与本研究结果相符;三组小鼠的肿瘤体积与重量比较，差异有统计学意义（P<0.001），对照组最大，其次为单一用药组，最后为联合用药组。相关研究表明[15-17]，VEGF属于机体重要的一种血管生成因子，能够更高效地作用于人体血管内皮细胞，并加快分裂与增殖速度，从而促进新的血管生成。EGFR-TKIs能够降低人体VEGF的表达，这也是抑制肿瘤生长的一个重要原因。T790M突变可使原来受抑制的EGFR通路发生磷酸化，VEGF表达上调，肿瘤细胞发生增殖，如加用VEGF抑制剂可降低VEGF水平，从而抑制已经对EGFR-TKIs耐药的肿瘤细胞增殖，实现逆转EGFR-TKIs的耐药，与本研究结果具有一定相似性;通过对比小鼠肿瘤组织中MVD计数与VEGF表达发现，三组小鼠MVD计数与VEGF表达比较，差异有统计学意义（P<0.001），联合用药组的数值最小。当前很多学者将肿瘤微血管密度（micro-vascular density，MVD）作为一种肿瘤微血管形成程度的一个重要标志。因此本研究应用重组人血管内皮抑素和EGFR-TKIs联合使用能够降低MVD计数与VEGF表达，对肺癌肿瘤产生抑制作用;对比两组不同治疗方法对小鼠体内H1975细胞和ECV细胞的抑制作用发现，联合用药组的抑制率明显优于单一用药组（P<0.05），提示重组人血管内皮抑素和EGFR-TKIs联合使用对于H1975细胞与人脐静脉内皮细胞具有抑制作用。相关研究表明[18-19]，恩度与厄洛替尼对肿瘤细胞并没有直接杀伤作用，但能够抑制肿瘤细胞的生长，与本研究结果相符。

综上所述，恩度与厄洛替尼联合作用于肺癌肿瘤能够减小肿瘤大小，能够抵抗肿瘤，可用于EGFR-TKIs耐药患者中，值得临床推广。

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（收稿日期：2021-07-22）37F02D83-6E2B-4E2E-8EBA-CB51506ADABE