白藜芦醇通过PI3K/AKT信号通路抑制脂多糖诱导的人牙龈成纤维细胞炎症

王玉娇，李思玉，李俊雄，陈虹君 ，冯敬哲，邱亚 ，李丽华

(1.川北医学院口腔医学系；川北医学院附属医院，2.医学研究中心，3.口腔科，四川 南充 637000)

慢性牙周炎，是口腔最常见的疾病之一，也是目前成年人牙齿脱落的主要原因[1]，主要表现为龈下菌斑中的病原菌(例如牙龈卟啉单胞菌)导致的慢性炎症，会导致软组织的破坏，牙槽骨的吸收及牙齿的脱落[2]。牙周炎发病机理不清楚，防治难度较大，目前，中药或中药成分已经在包括牙周炎在内的难治性疾病中进行尝试，以期找到新的治疗策略。

牙龈卟啉单胞菌能够通过脂多糖及其产生的炎性细胞因子刺激宿主免疫反应[3]，其中促炎细胞因子白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)已被证明是导致牙周组织破坏的重要的细胞因子[4-5]。人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts，HGFs)主要存在于牙龈结缔组织中，在牙周组织的形成、再生、功能行使和修复中起着重要的作用[6]，不仅有较强的自我更新能力，而且有合成和降解胶原蛋白、弹力纤维等细胞外基质的功能[7]，由免疫细胞分泌的免疫因子调控，同时也会产生参与局部炎症的细胞因子[8-9]。因此，抑制炎症对慢性牙周炎治疗至关重要。

白藜芦醇(resveratrol，RSV)是一种安全有效的抗牙周炎的天然多酚植物抗毒素，具有抗氧化、抗癌、抗炎等生物活性[10-12]，可通过下调toll样受体(toll-like receptor，TLR)信号改善糖尿病老鼠的实验性牙周炎和抑制牙龈上皮细胞受脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激后炎症[13]。但是，RSV在LPS刺激的体外人牙龈成纤维细胞中的功能和机制尚未明确，尤其是促进健康作用的基本模式仍待探讨。PI3K/AKT 信号通路主要由胞内磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)组成，在细胞增殖、凋亡、肿瘤发生和转移以及癌症扩散中发挥关键作用，与慢性牙周炎及其他慢性炎症性疾病的发展相关[14]。因此，本研究拟探讨RSV如何通过PI3K/AKT信号通路在LPS刺激的人牙龈成纤维细胞中发挥抗炎作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 白藜芦醇(美国Sigma公司)；人牙龈成纤维细胞株 (上海佳和科技生物有限公司)；Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)培养基(武汉普诺赛公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(素尔生物科技有限公司)；放射免疫沉淀法裂解缓冲液(radio immunoprecipitation assay lysis buffer，RIPA)(南京海克尔生物科技有限公司)；二苯二酚酸(bicinchonininc acid，BCA)试剂盒(上海易色医疗科技有限公司)；PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT抗体(美国Abcam公司)；β-actin抗体(武汉爱博泰克生物科技有限公司)；牛血清白蛋白(北京全式金生物技术有限公司)；LY294002(美国 Sigma 公司)；增强型化学发光试剂(enhanced chemiluminescence，ECL)化学发光底物试剂盒(广州赛国生物科技有限责任公司)；IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α含量测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.1.2 仪器 蛋白电泳设备(美国Bio-Rad公司)；凝胶成像系统(美国Thermo Fisher公司)；细胞培养箱(美国Thermo Fisher公司)；酶标仪(美国Thermo Fisher公司)；光学显微镜(日本OLYMPUS公司)；台式低温离心机(美国Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和处理 将人牙龈成纤维细胞株传代培养5代，制备成4.0×104个/mL的细胞悬浮液，恒温箱过夜。取等量人牙龈成纤维细胞悬浮液接种于6孔板上培养，直到融合至约80%，加入含有FBS的DMEM 培养基继续培养。

1.2.2 细胞毒性分析 人牙龈成纤维细胞以5×103细胞/孔接种于96孔板内培养。设置空白对照组、RSV组、LPS组、LPS+RSV组。对照组：不做任何处理。LPS刺激组：加入牙龈卟啉单胞菌 LPS (1 μg/mL)；RSV-80 μmol/L组：加入RSV(80 μmol/L)；LPS+RSV组：加入牙龈卟啉单胞菌 LPS (1 μg/mL)和RSV(80 μmol/L)；继续培养24 h。RSV的浓度参考既往研究[15-16]。然后以10∶1的比例用DMEM 培养基稀释 CCK-8 试剂，并在每孔加入100 μL上述稀释液，轻轻敲击培养板混匀，在37 ℃的CO2孵箱中再培养2.5 h。 人牙龈成纤维细胞的生存能力通过细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8，CCK-8)测定，具体方法参照说明书。通过利用酶标仪检测各组在450 nm处的吸光度从而获得各组的细胞活力。该试验重复4次。

1.2.3 酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 人牙龈成纤维细胞接种于24孔板，密度为2×105/孔。实验一：设置空白对照组、LPS组、LPS+RSV组。对照组：不做任何处理。LPS刺激组：加入牙龈卟啉单胞菌 LPS (1 μg/mL)；LPS+RSV组：加入牙龈卟啉单胞菌 LPS (1 μg/mL)和RSV(80 μmol/L)；继续培养30 min。实验二：设置空白对照组、LPS组、LPS+RSV组、LPS+RSV+LY294002组。对照组：不做任何处理。LPS刺激组：加入牙龈卟啉单胞菌 LPS (1 μg/mL)；LPS+RSV组：加入牙龈卟啉单胞菌 LPS (1 μg/mL)和RSV(80 μmol/L)；LPS+RSV+LY294002组：加入RSV(80 μmol/L)和PI3K/AKT信号通路抑制剂(LY294002)，继续培养24 h。各组细胞培养上清液中IL-1β、 IL-6、IL-8、TNF-α的含量用 ELISA试剂盒测定，具体方法参照说明书。然后将培养板用磷酸盐缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤5次，每孔加入50 μL生物素化抗体工作液，置于37 ℃持续 20 min。如前述洗涤后每孔加入100 μL 洗涤酶结合工作液置于37 ℃持续10 min。而后每孔加入100 μL底物显色溶液，置于37 ℃避光持续 15 min后，每孔加100 μL停止液。吸光光度值在450 nm和570 nm的将被酶标仪测定。平行试验3次。

1.2.4 Western Blot分析蛋白表达水平 人牙龈成纤维细胞以1×106细胞/孔接种于6孔板上培养。实验一：设置空白对照组、LPS组、LPS+RSV组。对照组：不做任何处理。LPS刺激组：加入牙龈卟啉单胞菌 LPS (1 μg/mL)；LPS+RSV组：加入牙龈卟啉单胞菌 LPS (1 μg/mL)和RSV(80 μmol/L)；继续培养30 min。实验二：设置空白对照组、LPS组、LPS+RSV组、LPS+RSV+LY294002组。对照组：不做任何处理。LPS刺激组：加入牙龈卟啉单胞菌 LPS (1 μg/mL)；LPS+RSV组：加入牙龈卟啉单胞菌 LPS (1 μg/mL)和RSV(80 μmol/L)；LPS+RSV+LY294002组：加入RSV(80 μmol/L)和PI3K/AKT信号通路抑制剂(LY294002)，继续培养30 min。然后分组收集细胞，进行Western blot实验分析PI3K/AKT信号通路激活情况。细胞裂解产物用PBS洗涤3次再添加1%苯甲基磺酰氟的RIPA缓冲液中以裂解得到蛋白质。BCA测定试剂盒用于测定蛋白质浓度。在10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中，在每个通道上装载等量的蛋白质(40 μg)，并与分子量标准marker一起电泳。随后，将这些蛋白质转移到聚偏氟乙烯[poly(1,1-difluoroethylene)，PVDF]膜上，电流300 mA持续110 min。用10%脱脂奶粉封闭膜1 h并与相应的蛋白抗体或兔抗β-actin单克隆抗体孵育。然后把膜放在HRP山羊抗兔IgG中孵育。用凝胶图像处理系统分析光密度。随后，使用ECL系统对蛋白质条带进行可视化处理，β-actin作为负载对照。以β-actin为细胞总蛋白内参，计算各组蛋白质的相对表达量。试验重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 RSV对牙龈卟啉单胞菌LPS刺激的人牙龈成纤维细胞活力的影响

LPS刺激组、RSV-80 μmol/L组和LPS+RSV组处理人牙龈成纤维细胞，对细胞活力的影响与对照组相当，表明RSV对人牙龈成纤维细胞无毒性，并且作用方式为非特异性。见图1。

2.2 RSV抑制牙龈卟啉单胞菌LPS诱导的人牙龈成纤维细胞的炎症

LPS刺激导致人牙龈成纤维细胞中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α增加；在LPS刺激的人牙龈成纤维细胞中，80 μmol/L的RSV抑制了促炎因子IL-1β、 IL-6、 IL-8和TNF-α的产生，组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2.3 RSV抑制牙龈卟啉单胞菌LPS诱导下PI3K/AKT 信号通路的激活

在人牙龈成纤维细胞中，LPS刺激组p-PI3K和p-AKT表达水平均高于对照组(P<0.05)。80 μmol/L RSV处理LPS刺激的人牙龈成纤维细胞后，PI3K和AKT的磷酸化水平降低，然而PI3K和AKT的表达在3组中的差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

2.4 RSV通过PI3K/AKT 信号通路抑制炎症反应

在LPS+RSV+LY294002组中，LY294002进一步降低了PI3K和 AKT的磷酸化水平。ELISA结果显示80 μmol/L RSV导致IL-1β、 IL-6、IL-8 和 TNF-α表达下降。这一效应被LY294002增强，即在LPS+RSV+LY294002组，PI3K/AKT信号通路的抑制进一步降低了这些细胞因子水平。这些结果表明在LPS刺激的人牙龈成纤维细胞中，RSV通过抑制PI3K/AKT信号通路来抑制炎症反应。见图4及图5。

3 讨论

临床上牙周治疗主要通过洁治术、刮治术、根面平整术清除附着的牙菌斑，偶尔辅用抗生素以控制口腔微生物的形成。天然药物(中药)的有效成分低毒、高效，可抑制细菌耐药和感染，对慢性牙周炎治疗有益[17]。本研究中，RSV抑制促炎因子 IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表达进而调控LPS诱导的人牙龈成纤维细胞炎症反应。此外，本研究揭示了RSV通过抑制PI3K/AKT信号通路进而调节炎症反应。

RSV是一种含有对称二苯代乙烯结构的非黄酮类多酚化合物，隶属于非甾体类天然抗氧化剂，可从葡萄皮、浆果和花生中提取，具有多种生物活性和药理作用，其中抗炎作用已被广泛验证[18]。Park等[19]指出，RSV通过抑制 NF-κN 在白细胞中的激活，从而抑制脂多糖介导的内皮细胞粘附分子的表达和血管炎症。RSV和水飞蓟素的结合能够显著增强成纤维细胞的生存能力，并且RSV能抑制LPS介导的IL-6和IL-8表达[20]。RSV能减弱金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和牙龈卟啉单胞菌的增长和毒力因子的表达[21]。在实验性牙周炎大鼠模型中，RSV导致了牙槽骨再吸收和降低IL-17表达[22]。RSV还可通过SIRT1/FOXO3A 信号通路和UNX2基因的表达有效促进骨生成[23]。本研究证明RSV处理对于人牙龈成纤维细胞的生存能力没有明显影响，并且能够抑制LPS导致的人牙龈成纤维细胞中IL-1β、 IL-6、IL-8和TNF-α的升高，与前人研究结论相符合。

Tsai等[24]表明RSV通过阻断 PI3K/AKT信号通路抑制癌细胞的增殖和侵袭。PI3K/AKT信号通路是牙周炎治疗的关键介质。在牙龈上皮细胞中，牙龈卟啉单胞菌通过调节PI3K、AKT以及AKT 下游蛋白质 GSK3、mTOR和Bad的磷酸化水平，影响细胞存活和免疫反应[25]。牙龈卟啉单胞菌的LPS可通过 PI3K/AKT信号通路介导人牙龈成纤维细胞的自吞噬[26]。此外，大车前苷、咖啡酸苯乙基酯、杜鹃素等均能通过PI3K/AKT信号通路来抑制LPS刺激人牙龈成纤维细胞产生的炎症反应[27]。在实验性牙周病模型中，甲磺双环脲通过下调PI3K和AKT降低髓过氧物酶活性和MDA、 IL-1β和 TNF-α 的水平[28]。本研究结果也表明LPS能够刺激人牙龈成纤维细胞中PI3K/AKT 信号通路的激活，而RSV可抑制PI3K/AKT 信号通路的激活，PI3K/AKT 信号通路抑制剂(LY294002) 处理后，进一步降低了IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表达，提示RSV通过抑制PI3K/AKT 信号通路来减轻炎症伤害。

综上所述，在牙龈卟啉单胞菌LPS诱导的人牙龈成纤维细胞炎症中，RSV通过抑制PI3K/AKT 信号通路激活，降低炎症因子水平，为牙周炎的治疗提供了理论依据及新的方向。