结膜松弛症结膜组织中弹力纤维结构蛋白和交联酶的表达

干静云 李青松 詹月萍 符之瑄

【关键词】结膜松弛症;弹力纤维;弹力蛋白;原纤蛋白-1，赖氨酰氧化酶

【中图分类号】G644.5 【文献标识码】A 【文章编号】2026-5328（2022）03--01

结膜松弛症是一种与年龄相关的疾病，因松弛及非水肿性的球结膜堆积在眼球和下眼睑之间而引起[1]。透射电镜下，弹性纤维由径向排列的微纤维束围绕无定型的弹性蛋白核心构成[2]。弹性蛋白原通过交联而组装成弹性蛋白，微纤维束则主要由原纤维蛋白家族[3]组成。当身体发生贫血时，红骨髓造血功能会代偿性亢进，以产生更多的红细胞来纠正贫血。同理，我们提出弹性纤维也有类似的代偿机制。

为此，我们检测了结膜松弛症患者结膜组织中弹性蛋白、原纤维蛋白-1、赖氨酸氧化酶的表达。有趣的是，检测结果与假设并不相符。

方法和材料：

共收集结膜组织标本12例，标本全部来自右眼，其中6例来自对照组;6例来自CCh组。CCh的诊断基于张兴儒提出的诊断标准。手术方法均选用新月形切除术。

免疫组织化学方法：将石蜡切片在65℃的恒温烘箱中放置30 min。然后在二甲苯溶液中脱蜡。将脱蜡的载玻片分别置于100%乙醇，95%乙醇，85%乙醇和75%乙醇中5 min，然后用自来水洗涤10 min。将水合的载玻片在高压下置于柠檬酸钠缓冲溶液（pH 6.0）中15 min，自然冷却后，将其用0.02 M PBS洗涤3分钟x 3次。然后将载玻片置于3%H2O2溶液中约10 min，并用0.02 M PBS溶液冲洗3分钟x 3次。将一抗添加至玻片（选择最佳稀释比例），在湿盒中孵育，然后在室温下放置1小时。用0.02M PBS冲洗载玻片3 min×3次。将HRP标记的广谱二抗添加至玻片，在湿盒中孵育，并在室温下静置20-30分钟，然后用0.02 M PBS冲洗3 minx 3次。载玻片用DAB染色，当其颜色改变时，立即用自来水清洗。用苏木精对载玻片复染色，然后使其透明并密封。

总计进行了弹性蛋白，原纤维蛋白-1和LOX的免疫组织化学染色。在一抗孵育的实验步骤中，需要分别添加相应的抗体，其余步骤完全相同。抗弹性蛋白（代ab21610）纤维蛋白-1（代码ab53076）和LOX（代码ab31238）的一抗来自英国的ABCAM公司。

在200倍显微镜下观察经HE染色和醛红色染色的标本的细胞和弹性纤维的形态。在200倍显微镜下拍摄免疫组织化学染色的石蜡切片，并从每个切片中拍摄三个不同部分的照片。使用Image-Pro-Plus 6.0软件分析照片，并使用三个不同部分的光密度值的平均值代表结膜组织中每种蛋白质的含量。

使用SPSS21.0统计软件进行分析。测量数据以均数±标准差（±s）表示。

本研究遵循赫尔辛基宣言，均取得上海中医药大学附属普陀医院伦理委员会批准及患者的知情同意。

结果：

CCh组的6例患者中，男性3例，女性3例，年龄64-83岁（72.55±6.51）。对照组的6例患者中，男性2例，女性4例，年龄65-79岁（69.66±5.64）。

在200倍的显微镜下观察HE染色的结膜组织，可见其上皮层为深红色，上皮细胞核为蓝色。对照组（A）的上皮层为扁平上皮细胞。相反，CCh组（B）的上皮层的层数明显增加，并伴有角化不全（图1）。

讨论：

免疫组化结果表明和对照组比较，CCh患者结膜组织中结构蛋白Elastin、Fibrillin-1的表达是降低的。Elastin由可溶性的前体-弹力蛋白原互相交联装配而成。在弹力蛋白原被释放到细胞表面之前，弹力蛋白结合蛋白和弹力蛋白原结合，防止它在形成弹力蛋白前被破坏。它构成弹力纤维的无定型蛋白核心。

结膜固有层中弹力纤维破坏后明显减少可引起球结膜弹性下降、张力降低。进而球结膜与眼球的附着力下降，在下睑缘的反复挤压下形成皱褶。结膜皱褶突出于眼球表面曲面，影响眼泪的流动和泪河的形成。引起CCh患者的泪液排泄延缓和清除延迟。泪液清除延迟反过来又导致泪液中上述炎症因子大量堆积，如此形成恶性循环，最终导致结膜松弛不断地加重和进展。

由上可知，目前对CCh发病过程的认识着重点在于弹力纤维的破坏、降解、变性。本研究的结果提示CCh发病机制不仅仅局限于弹力纤维降解的一面，还存在弹力纤维的合成不足的一面，实验结果表明和对照组比较，CCh患者结膜组织中交联酶Lox的表达是无差异的。赖氨酰氧化酶是一种铜依赖性胺氧化酶，其家族共有五个成员：Lox和赖氨酰氧化酶样蛋白1-4（LOX-like proteins 1-4，Loxl1-4）。

LOX具有稳定细胞外基质、调节细胞表型、抗肿瘤和趋化作用。Elastin和胶原蛋白是LOX家族的特征性生理底物。通过此作用使Elastin和胶原蛋白发生共价交联成弹力纤维和胶原纤维，弹力纤维和胶原纤维在LOX的作用下进一步发生共价交联成稳定的网状结构。共价交联为弹力纤维和胶原纤维提供大部分拉伸强度和结构完整性。实验结果意味着它大概率并不涉及在CCh的发病机制中。

虽然参与弹力纤维合成的蛋白质分子很多，但Elastin、Fibrillin-1、Lox在弹力纤维的装配中起比较重要的作用。此外，研究成本和研究者的精力的限制使得它们被选作研究对象。

人体结膜组织菲薄，手术切除得到的离体标本分量少，组织匀浆的量不足以进行蛋白质印迹法的检测。它也不符合酶联免疫吸附试验的检测条件。因为免疫组化法可对蛋白进行定性和定量研究，且特异性强，敏感性高，对目标蛋白的行定位准确，对组织标本的大小无特殊限制和要求，最终本研究采用免疫组化法检测Elastin、Fibrillin-1、Lox在结膜组织中的表达。

参考文献：

[1]Hughes WL.Conjunctivochalasis[J].Am J Ophthalmol.1942;25：48-51.

[2]Gan JY，Li QS，Zhang ZY，et.al.The role of elastic fibers in pathogenesis of conjunctivochalasis[J].Int J Ophthalmol.2017;10（9）：1465-1473.DOI：10.18240/ijo.2017.09.21

[3]A.GARNER，R.A.ALEXANDER.Histochemistry of elastic and related fibres in the human eye in health and disease[J].Histochem J.1986;18：405-412.

*通訊作者：李青松（1969，11）女，博士，主任医师，眼科主任，研究方向：眼表泪液学。

【基金项目】普陀区卫生系统自主创新科研资助项目（ptkwws201812）