免疫亲和柱净化-柱前衍生-高效液相色谱法测定中药薏苡仁中的伏马毒素

张 太， 毛 丹， 王少敏， 刘贤贤， 周 恒， 季 申*，1

(1.上海中医药大学中药学院，上海 201203；2.上海市食品药品检验研究院，国家药品监督管理局中药质量控制重点实验室，上海 201203)

伏马毒素(Fumonisins,FBs)是一类由镰刀菌属真菌串珠镰刀菌、多育镰刀菌、轮状镰刀菌和尖孢镰刀菌等代谢产生的真菌毒素[1]。1988年，Glomelderd等人[2]首次分离纯化出FB1和FB2[2]。目前，已发现28种FBs类似物，分为A、B、C和P四组，其中FB1、FB2、FB3是自然界存在最普遍且毒性最强的3种毒素。FBs可导致马产生白脑软化症，猪产生肺水肿综合征[3]。同时有研究表明FBs和人类的食道癌和神经管缺陷有关[4]。1993年，国际癌症研究中心(IARC)将FBs列为2B类致癌物质[5]。

FBs污染大多存在于玉米及玉米制品中，在大米、小麦、生咖啡、调味品、啤酒以及中药材中也有检出[6 - 8]。国际食品法典委员会(CAC)规定玉米中FB1和FB2的总量为4 000 μg/kg，玉米粉和玉米渣中总量为2 000 μg/kg；美国对脱胚的干磨玉米制品、制爆米花的净玉米、部分脱胚的干磨玉米制品中FBs(FB1、FB2、FB3)的限量分别为2 000、3 000、4 000 μg/kg[9]。FBs的检测有薄层色谱法、酶联免疫吸附法、核酸适配体、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等方法[10 - 12]。其中，薄层色谱法灵敏度低、重现性较差；酶联免疫吸附法假阳性率高，不能准确定量；核酸适配体受环境影响较大。液相色谱法因其灵敏度高、定量准确，被广泛应用于FBs的检测。FBs没有紫外吸收基团，也没有荧光特性，应用液相色谱法进行检测时，一般使用邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生FBs生成具有荧光的衍生物，从而可以采用荧光检测器进行定量分析[13 - 15]。

薏苡仁(Coicis Semen)为禾本科植物薏苡(Coixlacryma-jobiL.var.mayuen(Romen)Stapf)的干燥成熟种仁，具有利水渗湿、健脾止泻等作用。与其他种仁类中药类似，薏苡仁富含油脂、淀粉等化学成分，在种植、采收、储存等过程易发生霉变，进而被FBs污染。本研究建立了免疫亲和柱净化-自动柱前衍生-高效液相法测定薏苡仁中FB1、FB2和FB3的含量，为准确反应薏苡仁中FBs污染水平提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国，Agilent公司);1500振荡器(美国，Spexsampleprep公司);Eppendorf 5810R高速冷冻离心机(德国，Eppendorf公司);Sartorius CP225D分析天平(美国，梅特勒-托利多仪器有限公司);Milli-Q纯水仪(美国，密理博公司);免疫亲和柱(普瑞邦公司)。

FBs对照品溶液：将FB1、FB2和FB3标准品(普瑞邦公司)用乙腈-水(1∶1)配制成5 μg/mL的混合储备溶液，于-20 ℃保存，使用前根据需要将储备溶液稀释。甲醇、乙腈(色谱纯,德国Merck公司);KCl、NaH2PO4、H3PO4、NaB4O7·10H2O、NaCl、KH2PO4(上海凌峰化学试剂有限公司);2-巯基乙醇(美国Fluka公司);邻苯二甲醛(美国Pickering公司)。

1.2 样品前处理

精密称取薏苡仁样品粉末约2 g(过二号筛)，置于50 mL聚苯乙烯具塞离心管中，加入甲醇-乙腈-水(1∶1∶2)混合溶液25 mL，高速振荡10 min，离心10 min(4 000 r/min)，移取上清液10 mL，于50 mL容量瓶中，用吐温-20/磷酸盐缓冲溶液(称取8.0 g NaCl、1.2 g NaH2PO4、0.2 g KCl、0.2 g KH2PO4，用980 mL水溶解，然后用HCl调整pH至7.4，用水稀释至1 000 mL，最后加入1 mL 吐温-20，混合均匀)稀释至刻度，混匀，离心10 min(4 000 r/min)。移取上清液20 mL通过免疫亲合柱，流速3 mL/min，用20 mL水清洗，弃去全部流出液。用0.75 mL 0.1%甲酸甲醇洗脱两次，合并洗脱液，置于2 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.22 μm)滤过，取续滤液，即得。

1.3 自动柱前衍生程序及色谱条件

Kinetex-C18反相色谱柱(150 mm×4.6 mm，2.6 μm)；流动相A为甲醇，B为0.1 mol/L KH2PO4(H3PO4调节pH=3.3)，等度洗脱(A∶B=(68∶32)；流速0.8 mL/min;进样量：40 μL;柱温：40 ℃；荧光检测器：激发波长335 nm，发射波长440 nm。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

FBs常采用乙腈-水或甲醇-水提取。本研究比较了水、甲醇-水(1∶1)、乙腈-水(1∶1)、甲醇-乙腈-水(1∶1∶2)、甲醇-乙腈-水(1∶1∶1)5种溶液提取FBs的回收率。结果见表1，使用甲醇-乙腈-水的回收率高于其他提取液,FB1、FB2、FB3的回收率均在80%以上。实验选择甲醇-乙腈-水(1∶1∶2)为提取溶剂。

表1 不同提取溶液下薏苡仁中FB1、FB2、FB3的平均回收率

2.2 色谱条件的确定

2.2.1 色谱柱的选择分别考察了Kinetex XB-C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)、Kinetex XB-C18柱(150 mm×4.6 mm,3.6 μm)和Kinetex C18柱(150 mm×4.6 mm,2.6 μm)三种色谱柱，其中Kinetex C18色谱柱的分离度高、对称因子好，最终选择该色谱柱分离目标化合物。

2.2.2 流动相的选择液相色谱法检测FBs，流动相常用甲酸缓冲盐-甲醇和磷酸缓冲盐-甲醇体系。经过比较，选择基线平稳的0.1 mol/L NaH2PO4-甲醇为流动相。0.1 mol/L NaH2PO4的pH值为4.5，不能很好的分离FB2和FB3，需要使用H3PO4调剂pH值来达到更好的分离度。实验发现，当pH值达到3.3时，FB2和FB3的分离度为2，满足分离的要求。最终确定流动相为0.1 mol/L Na2H2PO4(H3PO4调pH=3.3)-甲醇(32∶68)。选定色谱条件下FB1、FB2和FB3的色谱图见图1。

图1 伏马毒素B1、B2、B3的液相色谱图(pH=3.3)Fig.1 Liquid chromatogram of FB1,FB2 and FB3(pH=3.3)

2.3 进样程序的确定

自动进样程序的混合功能在次数设置较少的时候常出现混合不完全的情况，因此比较了混合次数。结果表明：混合次数为15次以上时，FB1、FB2和FB3的峰面积均不再增加，证明FBs与衍生试剂能够完全混合。最终将衍生次数设置为15次。

为保证所用标准品溶液及样品溶液都能衍生完全，分别使用线性范围浓度最高的标准品溶液、加标供试品溶液与衍生溶液混合进行比例考察。结果表明当衍生试剂与标准品溶液的比例为4∶10时，标准品溶液即衍生完全。但由于样品溶液中可能存在其他化合物影响FBs的衍生化，只有当衍生试剂与溶液比例达到8∶10时，才能够完全衍生。因此，最终衍生试剂与溶液比例选为8∶10。

2.4 回收率与精密度

将浓度为5、10、20、50、100、200 ng/mL的FB1、FB2、FB3混合标准溶液用“1.4”的方法进行测定，以峰面积为Y轴、浓度为X轴绘制标准曲线，线性方程见表2。FB1、FB2、FB3在5～200 ng/mL范围内线性关系良好，线性相关系数(r)分别为1.0000、0.9999、0.9998。以信噪比3∶1和10∶1分别确定检出限(LOD)和定量限(LOQ)，FB1、FB2、FB3检测限分别为6、10、10 μg/kg；定量限分别为20、30、30 μg/kg(表2)。

表2 方法的线性关系、检测限及定量限

在阴性样品中分别添加50 μg/kg、250 μg/kg、1 000 μg/kg低中高3个水平的伏马毒素，按照“1.3”和“1.4”的方法进行测定，3个加标水平平均回收率分别为83.97%、81.58%、81.45%以上，相对标准偏差(RSD)分别为3.46%、3.64%和3.44%。

2.5 方法应用

根据建立的方法对21批薏苡仁(由上海青浦中药饮片有限公司、上海和堂中药饮片公司等提供，经上海食品药品检验研究院鉴定为薏苡仁)样品进行分析。检测结果表明，薏苡仁易受FBs的污染，其中FB1检出率为66.7%，浓度范围13～447 μg/kg。FB2和FB3仅有一批检出，分别为31 μg/kg和47 μg/kg。

3 结论

本文建立免疫亲和柱净化-柱前衍生-液相色谱测定薏苡仁中伏马毒素的方法，样品经甲醇-乙腈-水(1∶1∶2)提取，免疫亲和柱净化，设置自动进样程序使用OPA衍生伏马毒素。有效解决了伏马毒素的OPA衍生物不稳定问题，节省大量人工成本。本方法准确度、精密度和线性等均满足相应要求，可为薏苡仁中伏马毒素的风险评价提供分析方法。