10份柠檬种质花粉形态观察

林秋金　王龙平　谢晓清　王美盛　林秀香

摘  要：為了明确柠檬不同种质花粉的形态特征及各种质之间的亲缘关系，为柠檬种质的鉴定和创新利用提供重要的参考，本研究以10份柠檬种质的花粉为试材，通过场发射环境扫描电镜对花粉形状，花粉大小及花粉外壁纹饰等形态特征进行观察，并进行比较分析。研究结果表明：柠檬花粉存在形式为单粒，花粉粒外部形态呈圆球形、近长球形或长球形，具有4～5条萌发孔沟，萌发孔沟沿极轴方向以等距环状分布，沟长直达两极。不同种质的花粉形状、花粉大小、花粉外壁网眼密度和网眼大小等均存在差异。极轴长33.56～41.20 μm，赤道轴长22.06～33.70 μm，花粉大小（P×E）为844.90～1385.98 μm²。花粉外壁纹饰为网状雕纹，网脊宽为0.39～0.88 μm，网眼直径为0.87～1.68 μm，网眼表现为圆形、近圆形或不规则多角形。花粉大小等级为中等，极面观为四裂圆形或五裂圆形，赤道面观为圆形，椭圆形或长椭圆形。10份柠檬种质在花粉形状、大小、外壁纹饰等方面表现出多样性，可作为区分柠檬不同种质的依据。

关键词：柠檬;花粉;形态特征;扫描电镜中图分类号：S666.5       文献标识码：A

Observation on Pollen Morphology of 10 Lemon Germplasms

Abstract： Pollen morphology has a certain value in conservatism， so it is often used as a classification basis for plant resources. In order to clarify the pollen morphology and relationship among different lemon germplasms， which would provide an important reference for the identification and innovative utilization of different lemon germplasms. In the flowering period （February to March）， the flowers were picked up in the upper part of the crown periphery from robust plants， and the petals and calyx were removed with sterile tweezers. The anthers were placed indoors in the shade for 3 days. The pollens were collected and stored at low temperature. The pollens were used as the test materials and the morphological characteristics of pollen shape， pollen size and pollen exine ornamentation morphology were observed by the field emission environmental scanning electron microscope. Six quantitative features， including equatorial axis length， polar axis length， polar axis equatorial axis ratio， polar axis equatorial axis product， width of net ridge， mesh number were investigated. Data were normalized by DPSv3.01 software and clustered. The genetic distance was calculated as the euclidean distance， and the UPGMA method was used for the cluster analysis. The results showed that lemon pollen existed in the form of single grain， which was spherical， long spherical， nearly spherical， with 4–5 germination pore grooves. The germination pore grooves were distributed in an equidistant ring along the polar axis， and the groove length reached the two poles. The pollen shape， pollen size， mesh density and mesh diameter were different. The polar axis length was 33.56–41.20 μm. The equatorial axis length was 22.06–33.70 μm. The pollen grain （P×E） size was 844.90–1385.98 μm². The pollen exine ornamentation was reticular ornamentation. The width of net ridge was 0.39– 0.88 μm. The mesh diameter size was 0.87–1.68 μm. The mesh was round， nearly round or irregular polygon. The pollen was medium-sized， the polar view was tetragonal or pentagonal， and the equatorial view was round， elliptic or oblong. Ten lemon germplasms showed diversity in pollen shape， size and exine ornamentation morphology， which could be used as a basis to distinguish different lemon germplasms. Femminello lemon （4×） had the largest pollen grain size， which was significantly larger than that of other germplasms. However， since only Femminello lemon （4×） was a ploidy variant in this study， whether the ploidy of lemon could be identified by observing the size of pollen needs further research.2F81365C-BB41-4CB9-A459-2AED64816F72

Keywords： lemon; pollen; morphological characteristic; SEM

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.05.012

柠檬[Citrus limon（L.） Burm.f.]又称柠果、洋柠檬、益母果等，为芸香科柑橘属常绿小乔木，果实中含有糖类、钙、磷、铁、锌和维生素C、B1、B2等多种营养成分，还含有有机酸、黄酮类、挥发油、橙皮甙等，对人体十分有益，具有较高的食用和药用价值^[1-3]。现主要分布在热带和亚热带地区的美国、巴西、意大利、阿根廷、澳大利亚等^[4]。柠檬在我国种植区主要集中在四川安岳和内江、云南德宏，主要栽培品种为尤力克、费米耐劳、里斯本，品种结构单一，已不能满足柠檬生产和市场的需要。近年来，各地区加大对品种引进与选育的力度，使得资源不断丰富^[5-9]。目前美国、澳大利亚、西班牙等柑橘科研大国在柠檬品种选育及砧木改良方面的研究较为深入，国内柠檬研究与产业发展均相对滞后。刘文婷等^[9]引进台湾柠檬新品种在宁德试种及栽培，牛先前等^[10]对9份柠檬种质资源的物候期进行了观测，杜玉霞等^[11]研究了施肥量对柠檬幼树矿质养分、产量及品质的影响，王海鸥等^[12]探索了不同干燥方式对柠檬片干燥特性及品质的影响，尤桂春等^[13]对13份柠檬种质资源表型性状遗传多样性进行分析，王自然等^[14]对云南的柠檬灰霉病为害症状与发病适期进行观察，研究领域主要涉及引种及栽培配套技术、加工和贮藏保鲜技术、果实品质的测定评价、资源多样性研究等，对于柠檬花粉形态特征的研究报道较少。尤桂春等^[15]对10份柠檬种质的花粉形态进行了扫描电子显微镜观察，并根据花粉的某一或某两个性状特征来区分不同的种质，由于采用的性状特征数量有限，很难代表不同柠檬种质的综合性状特征。本研究利用扫描电镜对10份柠檬种质花粉形态特征进行观察，在综合分析不同柠檬种质花粉的形态学性状指标的基础上运用DPS v3.01统计分析软件进行聚类分析，它是基于性状间的相关性与欧式遗传距离大小对不同柠檬种质遗传亲缘关系的分类，能比较客观地反映出分类群之间的内在遗传关系，可為柠檬种质的鉴定和创新利用方面提供重要的参考。

1  材料与方法

1.1 材料

供试材料为福建省热带作物科学研究所柠檬种质资源圃收集的10份资源：泰国中果、台湾大果、四倍体费米耐劳、尤力克、香水柠檬、白花费米耐劳、粗柠檬、广东柠檬、越南青、红花柠檬。

1.2方法

在盛花时期（2—3月），选择健壮的柠檬植株，采集树冠外围中上部含苞待放的花蕾，用消过毒的镊子去掉花瓣和雌蕊，只留花药，置于室内阴干3 d，将获得的花粉放置于干燥管中，保存在4℃冰箱中备用。检测时将干燥花粉均匀地撒在粘有导电胶的样品台上，用离子溅射仪进行真空喷金镀膜，在场发射环境扫描电镜下进行观察。选择有代表性的视野进行观察和拍照，500倍观察花粉粒的群体形态，3000倍观察花粉赤道面，3500倍观察花粉极面，10 000倍观察花粉外壁纹饰，并测量极轴长（P）、赤道轴长（E）、网脊宽度及网眼直径。文中术语的描述及所定标准主要参考《孢粉学手册》^[16]和王开发等^[17]的文献。

1.3 数据处理

每份材料选取20粒饱满的花粉粒进行相关数据的测量，采用Excel 2007和DPS v3.01软件进行统计分析，品种间显著性差异采用Tukey法进行比较。选取赤道轴长、极轴长、网脊宽度、P/E值、P×E值、50 μm²网眼数共6个定量特征，用DPS v3.01软件进行系统聚类分析，采用欧氏距离类平均法。

2  结果与分析

2.1 柠檬花粉的萌发器官

10份柠檬种质花粉的萌发器官均为孔沟类型（图1），即花粉表面同时存在着孔和沟。花粉粒大多具有4～5条孔沟，四倍体费米耐劳具有5条孔沟的花粉多，四条孔沟的花粉少，台湾大果、

尤力克柠檬和白花费米耐劳具有5条孔沟的花粉少，4条孔沟的花粉多，其余种质的花粉只具有4条孔沟。萌发孔沟沿极轴方向以等间距环状分布，从极面可以观察到4～5条，从赤道面可以观察到1～3条，沟长直达两极。

2.2  柠檬花粉的形态和大小

10份柠檬种质的花粉均以单粒形式存在（图1）。花粉粒最长轴的长度在33.56～41.20 μm之间（表1），按照埃尔特曼的划分标准，花粉大小等级属于中等。从极轴的长度来看，四倍体费米耐劳最长，为41.20 μm，与香水柠檬（38.91 μm）差异显著，与其他种质差异极显著;香水柠檬、广东柠檬、红花柠檬、越南青柠檬和台湾大果柠檬的极轴长分别为38.91、38.36、37.56、37.39和37.26 μm，之间差异不显著;香水柠檬与泰国中果（36.61 μm）差异显著，与粗柠檬（35.36 μm）、尤力克柠檬（34.97 μm）和白花费米耐劳（33.56 μm）差异极显著。从赤道轴的长度来看，四倍体费米耐劳最大为33.70 μm，极显著大于其他种质，尤力克（30.09 μm）与白花费米耐劳（29.15 μm）差异不显著，与其他种质差异极显著。从P×E值进行花粉大小比较可以看出，四倍体费米耐劳的花粉粒（1389.66 μm²）最大，极显著大于其他种质。2F81365C-BB41-4CB9-A459-2AED64816F72

P/E值的大小用于反映花粉的形状，10份柠檬种质花粉的P/E值在（1.15±0.02）～（1.75±0.08）之间（表1），依据王开发等^[17]的方法判断其花粉粒形状为圆球形、近长球形或者长球形。赤道面观为长椭圆形、椭圆形或者近圆形，极面观为四裂圆形或五裂圆形。其中广东柠檬的P/E值最大，为1.75，与越南青柠檬（1.66）和香水柠檬（1.66）差异不显著，与泰国中果（1.54）差异显著，极显著大于其他种质;尤力克、四倍体费米耐劳和白花费米耐劳的P/E值分别为1.16、1.24和1.15，之间差异不显著，极显著小于其他种质。

2.3 柠檬花粉外壁纹饰

从图1中1D～10D可以看出，10份柠檬种质花粉的外壁纹饰均为网状雕纹，网脊平滑。网眼圆形、近圆形或不规则多角形，形状多样。网脊宽度、网眼大小和网眼分布密度在不同种质间差异达极显著（表2）。其中，尤力克和台湾大果的网脊宽均为0.88 μm，二者之间差异不显著，极显著大于其他种质，泰国中果和香水柠檬的网脊宽分别为0.42 μm和0.39 μm，极显著小于其他种质。50 μm²网眼数以越南青最多，为26.91个，与红花柠檬（23.42个）和广东柠檬（22.87个）差异不显著，与白花费米耐劳（21.33个）差异显著，极显著多于其他种质。而香水柠檬、泰国中果，粗柠檬、四倍体费米耐劳、台湾大果和尤力克网眼数较少，这些种质之间差异不显著。香水柠檬、粗柠檬和台湾大果的网眼直径比较大，分别为1.68 μm、1.68 μm和1.63 μm，白花费米耐劳（0.87 μm）最小。

2.4  柠檬花粉的整齐度

观察表明：泰国中果、越南青、广东柠檬、香水柠檬和粗柠檬花粉比较整齐，其形态表现基本一致，均呈长球形，其中发育不良，畸形的异型花粉粒占比少（小于10%），而四倍体费米耐劳，白花费米耐劳、台湾大果、尤力克和红花柠檬花粉整齐性相对较差，空瘪花粉和畸形的异型花粉占比高（40%～60%），饱满的花粉粒有2～3种表现形态。

2.5 聚类分析

利用DPS v3.01统计软件的系统聚类法对极轴、赤道轴、P/E、P×E、网脊宽、50 μm²网眼数共6个定量特征进行聚类分析。数据经过标准化后，以欧氏距离计算，其中最长距离法、WPGMA法、类平均法、可变类平均法和离差平方和法5种方法聚类结果一致，图2为类平均法聚类图，在遗传距离3.0处将试验材料分为3个组群。第

一组包括泰国中果、粗柠檬、香水柠檬、广东柠檬和越南青共5份种质，该组主要特征是网脊窄（0.39～0.63 μm），花粉较小（844.90～916.64 μm²）;第二组为台湾大果、尤力克、红花柠檬和白花费米耐劳共4份种质，该组特征为网脊宽较宽（0.69～ 0.88 μm），花粉较大（969.47～1054.77 μm²）;第三组为四倍体费米耐劳，特征为花粉粒大（1385.98 μm²），网脊中等（0.69 μm）。由此可見，通过柠檬花粉形态的花粉大小、网脊宽度、网眼密度等数量特征聚类分析可大致反映不同种质间的亲缘关系。

3  讨论

本研究结果表明：10份柠檬种质的花粉均以单粒形式存在，外部形状为圆球形、近长球形和长球形，花粉大小（P×E）为（33.56～41.20）μm×（22.06～33.70）μm，大小为中等，与武晓晓等^[18]、叶荫民等^[19]的研究结果较为一致。而尤桂春等^[15]研究10份柠檬种质花粉形态，认为花粉形状为扁球形、近球形、长球形，花粉大小（P×E）为（10.01～ 14.84）μm×（8.63～16.56）μm，花粉大小等级为小花粉，与本研究的结果差异大。究其原因可能是：应用扫描电镜对花粉形态进行观测，对样品的处理方式不同，导致观察的结果差异很大^[20]，还可能与花粉采集的时间及测量的仪器设备不同等因素有关，导致研究结果缺乏可比性。

本研究结果表明10份柠檬种质花粉的外壁纹饰为典型的网状雕纹，从孢粉学进化观点看，这种网纹属于比较进化的孢粉类型^[21]。网脊宽度、网眼大小和网眼密度在不同的种质之间差异达极显著。聚类结果显示10份柠檬种质在遗传距离3.8处聚为两类，四倍体费米耐劳（倍性变异种）单独聚为一类，其余9份种质聚为一类。其余9份种质在遗传距离3.0处又聚为两类，其中泰国中果、粗柠檬、香水柠檬、广东柠檬和越南青5份种质聚为一类，台湾大果、尤力克、红花柠檬和白花费米耐劳4份种质聚为一类。而进一步的聚类结果（红花柠檬除外）与形态学特征较为一致。红花柠檬从宏观形态特征（花果实的性状，种子数量，种子形态等）方面表现出与其他9份种质差异明显，本研究聚类分析显示出其与白花费米耐劳的亲缘关系最近。四倍体费米耐劳和白花费米耐劳同为费米耐劳柠檬的不同品系，从理论上推测它们的亲缘关系应较近，但二者在形态特征上差异很大，在本研究中四倍体费米耐劳单独聚为一类。研究表明用花粉形态特征进行聚类能粗略反映不同种质之间的遗传距离，但难以准确聚类每一份种质，对于较为特殊的种，如倍性变异种，就难以准确聚类。

已有研究发现，与同类二倍体植株相比，多倍体植株的器官更大，随着染色体倍性的增加，其花粉体积也会增大。晏春耕等^[22]研究认为苎麻的花粉大小与染色体倍性呈正相关;邓秀新等^[23]研究认为柑桔同源及异源四倍体花粉粒体积平均为二倍体的2倍或双亲之和;张成合等^[24]研究认为十字花科蔬菜不同倍性间，花粉大小差异十分明显，在光学显微镜下通过观测花粉的大小，便可对植株的倍性进行比较准确的鉴别，在植物多倍体育种中，可大大减少染色体数目鉴定的工作量。本研究结果表明四倍体费米耐劳花粉粒体量最大，极显著大于其他种质。但是由于本研究仅四倍体费米耐劳是倍性变异种，对于柠檬的倍性是否可以通过观测花粉的大小来鉴别，还需要进一步的研究。2F81365C-BB41-4CB9-A459-2AED64816F72

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