流式细胞术检测水中细菌总数的方法研究
2022-06-01刘小杰
刘 倩，刘小杰
（上海城建职业学院，上海 201415）
水环境中细菌的快速检测，一直是微生物学研究中的一个挑战性课题，特别是对于含有复杂微生物种群的天然水体。由于饮用水中的贫营养环境有别于传统培养基提供的富营养环境，大多数在显微镜下观察到的饮用水中细菌不能在传统培养基中生长，致使活菌计数结果偏低〔1-3〕。水体环境中污染物成分复杂，其中某些有机污染物会对附着其上的微生物产生持久性选择压力。近年来，饮用水中菌落总数快速检测技术发展很快，比较成熟的有化学发光法、ATP 生物发光法、固相细胞计数法等〔4-5〕，但这些方法还存在一些弊端。
流式细胞仪具有较高的检测灵敏度，可以用于检测液态商品中的细菌总数和细菌种类等〔6〕。T. S.GUNASEKERA 等〔7〕实现了用流式细胞术（FCM）快速检测牛奶中的菌落总数，S.N.LANGERHUUS 等〔8〕利用流式细胞仪，检测区分乳腺炎牛奶样品中的革兰氏阳性菌和阴性菌，C. QUIRÓS 等〔9〕在酒类发酵过程中，通过流式细胞仪进行了死活细胞的区分和酶活性的检测。国内诸多学者也开展了类似研究工作，大大扩展了流式细胞仪的应用范围〔10-13〕。
FCM 利用荧光染料染色后与SYBR Green 结合，从背景信号中区分微小的微生物细胞。在系统中引入自动细胞计数，阈值设置为SYBR Green-800（B530通道），采用50 μL 上样体积，35 μL/min 的上样速度，可以精确地确定细菌数量。
1 材料与方法
1.1 试剂、材料和仪器
SYBR Green 染料（美国赛默飞世尔）；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI，碧云天公司Beyotime C1005）；LB 培养基；平板计数琼脂；实验室自备E.coli菌株。
0.1 μm 过滤器（美国密理博，SLW033LS）；流式细胞仪（美国安捷伦，NovoCyte）。
1.2 样品处理
取12 支1.5 mL EP 管，分别标记为1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1 024和2 048，其中2～2 048管中加入250 μL过滤后的超纯水。1号管中加入500 μL水样原液，从1 号管中取250 μL 水样到2 号管中混匀。再从2 号管中取250 μL 水样到4 号管中混匀，依次梯度稀释下去。最终2 048 管中共有500 μL 水样，移出250 μL 即可。
1.3 荧光染色
每个EP管中含250 μL水样，加入5 μL SYBR Green染液，37 ℃水浴10 min，上机测试，未能马上测试的样本，置于4 ℃冰箱避光保存，2 h 内完成测试〔14-15〕。
1.4 FCM 测定
采用安捷伦NovoCyte 流式细胞仪，50 μL 上样体积，35 μL/min 的上样速度，阈值设置为SYBR Green-800（B530 通道），使用自动上样器自动采集上样。测定细胞死活时，加入DAPI，稀释1 000 倍，室温染色5 min 上机。
1.5 平板计数法活菌计数
采用平板计数法统计样品中活性菌浓度，采用FCM 法分别统计样品中活菌数、死菌数和细菌总数。平板计数法检测：无菌操作吸取1 mL 水样，注入一次性无菌平皿中，倒入46 ℃平板计数琼脂，重复三次。同时在另一个平皿直接注入培养基做空白对照。将平板放置（36±1）℃培养箱中培养48 h 后计数。
1.6 FCM 与平板计数法的验证试验
根据GB 5749—2006 生活饮用水卫生标准，微生物主要检测指标为总大肠菌群和菌落总数，因此本实验采用具有代表性的Escherichia coli斜面菌种。取E. coli斜面菌种1 支，无菌操作挑取菌苔，接种于LB 液体培养基中，37 ℃培养过夜后，作为菌悬液备用。用无菌移液枪移取1 mL 菌悬液于9 mL 蒸馏水样中，作为样品原液，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）对样品原液进行10 倍梯度稀释，每个稀释度样品分别进行FCM 检测和平皿计数检测〔参见（GB 4789.2—2016）食品卫生微生物学检验 菌落总数测定〕〔16〕。
1.7 数据分析
利用Excel 软件对数据进行统计学分析和处理。
2 结果与分析
2.1 流式体积法绝对计数的准确性和线性范围
调节荧光信号选择合适的细胞群，图1 显示了各稀释度下流式细胞仪测定图谱，其中最后两张图是密度图，样本浓度高时，密度图更容易看出分群情况。
图1 各稀释度下流式细胞仪测定图谱Fig.1 Flow cytometer measurement chart at various dilutions
实验的浓度倍数、折算后浓度倍数以及折算后浓度倍数对应的菌体绝对数见表1。
由表1 可知，1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1 024、2 048 这12 个管子测得的菌体绝对计数随着稀释倍数的增大而减少，通过数据分析对比，可以建立水样FCM 快速检测技术。
表1 浓度倍数、折算后浓度与对应菌体的绝对计数Table 1 Concentration multiples，converted concentrations and absolute counts of corresponding bacteria
梯度稀释流式体积法所得绝对计数与稀释倍数的线性关系见图2。
由图2（a）可知，数据整体线性良好，图2（b）为去掉原液和原液稀释2 倍的数值，可以发现线性关系更好，推测其原因为浓度高时，样本会有抱团。为证明此推测，对32 号和2 号管样本进行表征，结果见图3。
图2 菌体绝对计数与稀释倍数的线性关系Fig.2 The linear relationship between the absolute count of bacteria and the dilution dilution times
由图3 可知，浓度低时几乎无抱团现象，浓度高时会出现抱团；低浓度时阴性和阳性区分良好，但高浓度样本阳性群会左移，这是因为染料浓度一定，细菌数增多，而浓度不够导致信号偏弱。
图3 高低浓度样本抱团图谱Fig.3 Cluster map of high and low concentration samples
2.2 FCM 法测定活细菌浓度及总菌浓度
对水中进行细菌总量计数，可以反映水环境指标，根据GB 5749—2006 生活饮用水卫生标准，菌落总数不得超过100 mL-1，目前采用的方法多为HPC法，但存在操作时间长，且检测值比实际值低，有一定误差，这可能是由于这些细菌是非异养型细菌、处于亚致死性损伤状态或是活的，但处于不可以培养的状态。流式细胞仪可以检测饮用水中总菌数，更能反映真实细菌含量，在饮用水细菌计数方面，严心涛等〔17-19〕进行了深入研究和探讨，进一步分析了饮用水安全。本研究在高浓度样本中加入DAPI，结果见图4，可以清楚地看出死亡的菌落数。
图4 使用DAPI 检测活性细菌和非活性细菌Fig.4 Use DAPI to detect active and inactive bacteria
2.3 FCM 法与平板计数法的准确性
选取合适稀释度样品，分别进行平板计数，重复3 次，用3 次结果的常用对数值计算平均数及标准差，对比流式细胞仪，所得结果见图5，其相关性见图6。
图5 流式细胞仪与平板计数准确性比较Fig.5 Comparison of accuracy between flow cytometer and plate count
图6 流式细胞计数与平板计数相关性Fig.6 Correlation between flow cytometry and plate count
由图5、图6 可知，FCM 检测与平板法检测结果趋势上基本一致，从数值上来看，流式细胞的检测值都高于平板计数，对数值随稀释倍数基本成梯度变化。从数据分析可以看出，利用FCM 检测水中的细菌总数与平板法检测结果呈线性相关，〔R2＝0.991 9，相关程度为显著相关（P＜0.01）〕，检测结果的常用对数值基本一致，有很好的符合性。而1 024 管和2 048 管平板计数已无法计算对数值，这可能是因为某些细菌，虽然明显存在，但没有得到有效的培养，导致活菌计数结果偏低。
2.4 FCM 法与平板计数法的验证试验
将人工菌液分别以102～107mL-1的接种量添加到2048 号水样中，分别用FCM 和平皿菌落计数法进行细菌总数的分析和计数，结果见图7，其相关性见图8。
图7 FCM 与平板计数法的验证试验Fig.7 Validation test of flow cytometer and plate colony counting method
图8 流式细胞计数与平板计数相关性Fig.8 Correlation between flow cytometry and plate count
由图7、图8 可知，随菌液浓度梯度的增加，FCM与平板计数的检测结果基本一致。FCM 与平板计数法检测水样中细菌总数的结果呈正的直线相关（P<0.01），相关程度为显著相关（R2=0.996 9）。FCM检测到的对数值高于平板计数法，因此比平板计数法更加精确，这可能是因为流式细胞仪是对每一个被荧光染色的目标细菌进行计数〔6〕。
3 结论
流式细胞仪可快速高通量对细菌进行绝对计数，无需计数微球，节省成本，且流式细胞仪检测线性范围宽，灵敏度高。本研究利用流式细胞仪，对环境水中细菌总数测定方法进行了研究，建立了FCM检测环境水中细菌总数的方法，利用SYBR Green 和DAPI 可以检测活菌和死亡的菌体，更能反应出实际细菌总数，同时与国家标准检测方法进行了比较，验证了其准确性和灵敏度，检测的结果更准确，更可靠。
