傣药龙血竭对脑缺血大鼠的脑保护作用

张晓燕，蔡宇宇，王玉瑶，孙海珍

（黑龙江中医药大学 药学院，黑龙江 哈尔滨 150000）

龙血竭是一种红色的树脂，1972年在中国云南省发现的龙血竭（Longxue Jie）来源于百合目龙舌兰科剑叶龙血树 Dracaena cochinchinensis(Lour.)S.C.Chen 的树脂提取物，亦称“广西血竭”，是民族傣药“龙血竭”的主要来源。其药理作用有抗炎作用：临床上龙血竭合用美沙拉嗪能降低TNF-α、IL-6及CRP的水平，从而治疗结肠炎[1]，龙血竭能抑制肺组织的炎症程度和胶原过度沉积达到急性炎症治疗[2]；活血化瘀作用：研究表明PAI-1 能增加动静脉血栓形成的风险，龙血素B能有效的阻止uPA/PAI-1复合物的形成，抑制PAI-1的活性，而产生活血化瘀作用[3-4]；抗肝/肺纤维化作用：龙血竭抑制 IL-2和上调 IL-5等炎症因子，降低透明质酸和转氨酶而产生降低肝/肺纤维化的作用[5-6]。降糖、降脂作用：龙血竭的有效成分总黄酮能降低三酰甘油、总胆固醇，降低 IL-6，提高胰岛素产生降糖降脂的作用[7]。目前临床应用于心血管疾病[8]，皮肤科疾病[9-11]，妇产科疾病[12-13]，消化系统疾病[14-15]和肛肠科疾病[16-17]等。

脑缺血（Cerebral Ischemia，CI）是微循环障碍性疾病。临床显示，老年人是缺血性脑卒中的易患人群，可能与并发症高血压，高血脂有关[18]。脑卒中具有较高发病率、致死率、致残率、复发率特点[19]，中医认为，脑和五脏具有密切的联系，产生脑卒中病症时，有害物质可运送到重要器官，导致器官损伤。中药多成分，多靶点和良反应少[20]，因此在临床生有着重要意义。本文研究中药龙血竭抗脑缺血药效作用，为今后龙血竭在心脑血管疾病和神经保护领域奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 药品与试剂

龙血竭(龙血竭制成粉末，批号：20191106)：广西中医药研究院；脑心通胶囊（规格0.4 g/粒，批号：1911166）：陕西步长制药有限公司；2%TTC染液（批号 20190925）：北京索莱宝科技有限公司；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，批号：20090514）：天津市光复精细化工研究所；GSH-Px（批号：A005-1）、SOD（批号：A001-3）、MDA（批号：A003-1）、CAT（批号：A007-1-1）试剂盒：南京建成生物工程研究所；苏木精-伊红染液（HE，批号202105）：武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.1.2 试验动物

Sprague-Dawley大鼠，SPF级，雌雄各半，9周岁，体质量（260±20） g，由黑龙江中医药大学试验动物中心提供，合格证号：SCXK（黑）2018-007，饲养条件：温度 25 ℃，湿度 50%，昼夜间隔12 h，自由饮水。

1.2 仪器与设备

XW-80A涡旋混合器：上海琪特分析仪器有限公司；CM-36型圆形水浴氮吹仪：北京成萌伟业科技有限公司；M200 PRO酶标仪：瑞士帝肯集团公司；YD1508R轮转式病理切片机：德国徕卡公司；TB-P1自动包埋机：上海名元实业有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 造模

大鼠术进食供水12 h，以10%水合氯醛溶液腹腔注射大鼠，将四肢和头部固定在试验台上，颈正中剪开皮肤约2 cm切口，钝性分离，暴露左侧颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）、颈外动脉（ECA）。分离出CCA，找到动脉Y型分叉，取缝合线于左侧CCA远心端和近心端及ECA处挂线备用。用微动脉夹暂时夹闭 ICA，然后近心端结扎CCA、ECA。在CCA分叉处，近心端约4 mm处倾斜45度剪切口，将线栓（鱼线剪成5 cm长的线段，5 mm以下蘸取石蜡）从切口处朝 ICA入颅方向插入，感到有轻微阻力即停止。扎紧，缝合，将鱼线尾部露出体外。用灯照射保持肛温为37 ℃，90 min后将鱼线拔出约2 cm并剪去露出体外部分。假手术组仅将大鼠皮肤切开，剥离暴露CCA、ECA及ICA后缝合。

1.3.2 模型判断指标

采用Zea Longa5 级评分标准评价（无神经功能损伤（0分），对侧前肢伸展障碍（1分），向手术对侧打圈（2分），行走时向手术对侧倾倒（3分），意识昏迷（4分）），筛选成功模型（大于0分），未入选大鼠弃之。

1.3.3 动物分组与给药

将有效造模大鼠随机分为六组，分别为假手术组（Sham）、模型组（Model）、龙血竭组（高（DBH）、中（DBM）、低（DBL）组）和脑心通胶囊组（NXT），每组20只，灌胃剂量按照1 mL/100g计算，灌胃 1次/d，连续灌胃14 d。

假手术组（Sham）和模型组（Model）给予生理盐水。

龙血竭组：将其分为高（DBH）、中（DBM）、低（DBL）组，是通过取适量龙血竭混悬于0.5%羧甲基纤维素钠水溶液中，配制成浓度的分别2.16、1.08、0.54 g/kg的混悬液。

脑心通胶囊组（NXT）：规格为每粒 0.4 g，根据剂量换算，用纯水配制成浓度为54 mg/kg的混悬液。

1.3.4 检测指标

1.3.4.1 神经功能评分 在术后第 1、4、7、14 d参照改良神经功能缺损评分（mNSS），神经功能评分在0～18分之间，0分为正常；1～6分为轻度神经功能缺损；7～12分为中度缺损；13～18分为重度缺损。具体评分标准见表1。

表1 神经功能评分标准Table 1 Nerve function scoring criteria

1.3.4.2 脑组织含水量（%）及脑梗死体积测定脑组织含水量：各组随机选取6只大鼠，于第7 d灌胃给药后进行断头取脑，精密称湿重，后80 ℃干燥至恒重，称三次取均值。

脑组织含水量（%）=（脑组织湿重–脑组织干重）/脑组织湿重×100%

脑梗死体积（%）=（非缺血侧半球面积–缺血侧半球未梗死面积）/全脑面积×100%

1.3.4.3 HE染色和 TTC染色 将各组大鼠在术后第 14 d行神经功能缺损评分后，随机选取 12只，随机取6只用水合氯醛腹腔麻醉，打开胸腔、暴露心脏，剪开右心耳，自左心尖灌注0.9%氯化钠溶液，当右心耳流出无血色液体，断头取脑，大鼠的脑组织于–20 ℃冰箱中20 min后进行常规的TTC染色。其余6只进行相同步骤，通过氯化钠处理后，用4%多聚甲醛从左心尖灌注，当全身僵硬，迅速断头，取脑，置于4%多聚甲醛固定液中，进行HE染色。

1.3.4.4 对血清中的氧化应激水平的影响 将各组大鼠禁食供水12 h，水合氯醛腹腔注射麻醉，经腹主动脉采血，置于10 mLEP管室温静置1 h后，4 ℃，4 000 r/min离心10 min，合并同组大鼠血清。采用酶标仪对SOD、MDA、GSH-PX、CAT进行活性检测。

1.4 数据分析

神经功能行为学评分和脑组织含水量采用单因素方差分析（ANOVA），用spss25.0进行计算，结果用均数±标准差（X±S）表示，作图使用Graphpad Prism9，图像分析采用Image Pro Plus 6.0，两组间采用t检验，当P<0.05时，表示有显著性差异，具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 试验结果

2.1.1 对神经功能的影响

Sham组大鼠的神经功能从轻微损伤恢复至正常；Model组的神经功能缺损明显且损伤长期存在。给药组与Model组相比，给药组神经功能评分降低趋势一致，均有显著改善（P<0.01）；第14 d DBH/M组的神经受损恢复最好，且优于NXT组，见表2。

表2 各组大鼠神经功能评分比较Table 2 Comparison of neurological function scores in rats

2.1.2 对脑组织含水量及脑梗死体积的影响

相比 Sham 组，Model组大鼠脑组织含水量显著增加（P<0.01）。给药组大鼠脑组织含水量较Model组均低，具有显著的统计学差异（P<0.05或P<0.01），HBH与NXT两者的含水量基本相同，表明龙血竭可降低脑组织含水量，见表3。

表3 各组大鼠脑组织含水量Table 3 Percentage of brain water content in rats

Sham组可见均匀红色脑组织切片，脑组织切片未见梗死病灶（0.00%±0.00）,与Sham组相比，Model组大鼠术侧脑组织梗死明显且体积较大（45.13%±4.05，P<0.01）；与 Model组相比，各给药组白色梗死区域均相对减少，尤其是 DBH（32.42%±2.57，P<0.01）和 DBM 组（34.84%±3.30，P<0.05）。治疗效果优于 NXT组。认为龙血竭能够不同程度的改善脑组织供血不足，降低大鼠缺血侧脑梗死体积，见图1。

图1 脑梗死体积Fig. 1 Cerebral infarction volume

2.1.3 对脑组织学的影响

Sham组细胞完整，分布均匀，细胞核居中，核仁清晰。Model组中有明显组织结构异常，结构紊乱，细胞分布不均匀，可见大量细胞核移位及固缩，排列稀疏，血管周围V-R腔增宽。相比Model组，各给药组仅皮层少数细胞固缩，且DBH/M组可见异常变化较少，个别神经元固缩，皮层固缩细胞数量减少，小胶质细胞有显著修复，见图2。

图2 脑组织HE染色切片图Fig. 2 HE stained sections of brain tissue

2.1.4 对氧化应激的影响

与Sham组相比，Model组SOD活力下降显著（P<0.01），GSH-PX及CAT活力有所下降（P<0.05），MDA含量上升不明显（P>0.05）。与Model相比，龙血竭组SOD、GSH-PX活力均有显著提高（P<0.05 或P<0.01），且 DBH组能显著降低MDA含量（P<0.05）。其中，NXT组降低 MDA含量无统计学差异（P>0.05），提高 CAT、SOD活力作用有显著差别（P<0.05），见表4。

表4 对CI大鼠氧化应激水平的影响Table 4 Effects on oxidative stress levels in CI rats

2.2 试验分析

近年来大脑中动脉栓塞模型（MCAO广泛应用于脑缺血动物模型，因为它与人脑缺血相似，不需要颅骨切除，损伤小。脑缺血再灌注能使脑部造成更大的损伤，更好地模拟脑缺血的行为改变和病理特征[21]，由于脑缺血复杂的发病机制，包括兴奋毒性、离子失衡、氧化应激和炎性反应等[22]，防治脑缺血的问题也在更深层次的探索当中。脑缺血缺氧后，脑组织代谢异常、脑内氧化应激与自由基的过量产生，细胞膜通透性增加，低氧环境导致白细胞渗入低氧组织细胞水肿，引起血脑屏障渗漏和水肿，导致肿瘤坏死因子升高，从而引发细胞炎性因子释放，损伤脑组织中内皮细胞、神经元、胶质细胞，引起细胞酸中毒，能量代谢障碍等。随后导致神经细胞的凋亡，缺血再灌注期间神经功能的下降[23-26]。

当中枢神经系统被破坏，所产生的有害物质超出自生调节，由于脑部对缺血缺氧非常敏感，因此脑组织会产生微循环障碍，细胞膜通透性增加，引起脑组织含水量增加，细胞形态发生改变。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本，最广泛的技术方法[27]。苏木精染液为碱性，使细胞核内的染色质与胞质内的核酸显紫蓝色；伊红为酸性染料，使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。由试验[28]表明，颈动脉狭窄解除能够降低脑组织含水量，也使血脑屏障的通透性降低含水量。本试验中龙血竭组降低脑组织含水量，其可能是通过降低血脑屏障通透性而产生的效果。根据文献[29]可知，给药组多数神经细胞结构、形态改变相对较轻，核固缩少，排列整齐，这与本试验的结果一致，可推断出龙血竭能改善海马体组织，从而达到脑保护作用。脑缺血再灌注后引起一系列的氧化应激反应[30-31]，并且氧化应激负荷时，自由基产生过量，导致有害产物丙二醛（MDA）等水平升高，病情加重。而SOD、CAT、GSH-Px能清除过氧化物，起到保护细胞膜结构和功能的完整性[32]的作用。由研究[33-34]表明，不同浓度羽扇豆醇，能使血清 SOD和 GSH水平升高，MDA水平降低，从而增加抗氧化物酶活性，有效减少氧化应激损伤，与本试验结果一致，且DBH组降低MDA水平远远优于NXT组，表明龙血竭组有较好的脑保护作用。

严重脑缺血能大面积脑梗塞，当达到四分之三梗阻会出现偏瘫、偏身感觉障碍和嗜睡等现象[35]，TTC是脂溶性光敏感复合物，1958 年开始用来检测哺乳动物组织的缺血梗塞[36]。正常组织中脱氢酶活性高可与TTC反应显红色，缺血组织显白色。梁萍[37]研究中提到，脑梗死面积减小能恢复脑部神经和记忆，本试验龙血竭组能减少脑阻塞面积，且治疗效果优于 NXT组，有显著性差异（P<0.05），说明也有同样的脑保护作用。

3 结论

龙血竭可降低脑组织含水量和血脑屏障通透性，减轻神经细胞形态和结构的改变，抑制海马体组织的损伤，从而达到脑组织的保护作用；提高机体的氧化应激能力，增强人体的防御力和神经血管的结构和功能，改善脑缺血再灌注组织病理损伤；龙血竭还能缩小脑梗死面积，恢复大鼠的记忆和神经。说明龙血竭对大鼠脑缺血疾病有一定的保护作用。