基于近红外光谱技术快速定量分析天麻有效成分*

彭璐，钟淑梅，廖鹏程，范荫荫，胡昌强，覃冬玖

(九州天润中药产业有限公司，武汉 430050 )

天麻为兰科植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥块茎，主产于贵州、云南、四川、陕西等地，是我国名贵中药材之一，具平肝熄风、祛风定惊的功效，用于小儿惊风、癫痫、头痛、风湿[1]等。现代药理研究表明，天麻在缓解平滑肌痉挛、降低血压、增加智力和提高记忆力等方面有重要作用[2-6]。天麻素和对羟基苯甲醇为天麻的主要成分，近年来，大量文献报道巴利森苷A、B、C、E是天麻素和柠檬酸缩合而成的特殊化合物，具有中枢神经系统作用，为天麻的活性成分[7-8]。目前天麻的质量控制主要采用高效液相色谱(HPLC)法进行含量测定，该方法虽然准确，但样品前处理复杂，耗时耗力，时效性差，操作过程复杂，需各种有机试剂，污染环境，检测成本高，不适用于中药工业中多批次中药材及饮片的快速检测。近红外光谱技术(near-infrared spectroscopy，NIR)具有分析速度快、效率高、成本低、绿色环保等优点，目前已经在中药真伪鉴别、产地溯源、优劣、厂家鉴别、中药生产过程质量控制等方面应用[9-14]。笔者在本研究采用NIR和化学计量学建立天麻中天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、B、C、E 6种成分的定量分析模型，报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器 Corona Extreme型近红外光谱仪器(德国Carl Zeiss Spectroscopy 公司)，玻璃样品杯池，Inprocess光谱扫描软件(版本2.11.1.10485)，TQ Analyst 8.0分析软件(美国Thermo Fisher Scientific公司)，1260 系列高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。

1.2试药 对照品天麻素(批号：110807-201809，含量：96.7%)、对羟基苯甲醇(批号：111970-201702，含量：99.4%)均购自中国食品药品检定研究院；巴利森苷A(批号：A010586，含量≥98.0%)、巴利森苷B(批号：A010587，含量≥98.0%)、巴利森苷C(批号：A010694，含量≥98.0%)、巴利森苷E(批号：A010652，含量≥98.0%)均购自珠海安哲生物科技有限公司；95%乙醇(国药集团化学试剂有限公司，批号：20190704)，乙腈(美国Aavator公司，色谱纯，批号：00002309)，磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯，批号：20160629)。

实验所用样品包括安徽金寨和陕西汉中的不同等级的天麻样品66批次，经九州天润中药研究院吴卫刚副研究员鉴定为兰科植物天麻GastrodiaelataB1.的干燥块茎，样品来源具体信息见表1。

表1 66份天麻样品来源信息

2 方法与结果

2.1HPLC分析

2.1.1供试品溶液的制备 取天麻粉末(过三号筛)约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，称定质量，超声处理(120 W，40 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用稀乙醇补足减失的质量，滤过，精密量取续滤液10 mL，浓缩至近干无醇味，残渣加乙腈-水(3：97)混合溶液溶解，转移至25 mL量瓶中，用乙腈-水(3：97)混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.2对照品溶液的制备 取天麻素对照品、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E对照品适量，精密称定，加乙腈-水(3：97)混合溶液分别制成天麻素储备液(0.050 7 mg·mL-1)、对羟基苯甲醇储备液(0.026 4 mg·mL-1)、巴利森苷A、B、C、E储备液(浓度分别为0.232 8，0.342 4，0.090 0，0.295 6 mg·mL-1) 。

2.1.3色谱条件 使用Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B，3：97)为流动相梯度洗脱：0～10 min，3%→10% A ；>10～15 min，10%→12% A ；>15～25 min，12%→18% A ；>25～40 min，18%→82% A ；检测波长为220 nm，柱温为30 ℃，流速为0.8 mL·min-1，进样量10 μL。

2.2近红外光谱采集 取上述66 份天麻样品适量，粉碎，过孔径0.180 mm(80 目)筛。采用光栅式漫反射模式采集光谱，分辨率8 cm-1，扫描次数为64 次，扫描波长范围为950～1650 nm，温度为15～28 ℃，相对湿度为38% 。将收集到的样品粉末取约12 g，放入玻璃样品杯中，混合均匀，以空气为参比，扣除背景采集图谱，按上述实验条件进行扫描，每个样品重复扫描4次，求平均光谱。

2.3统计学方法 应用化学计量学软件TQ Analyst 8.0版分析软件采用偏最小二乘回归法(PLSR)建立天麻6种有效成分定量分析模型。

2.4结果

2.4.1HPLC分析 按“2.1.3 ”项下色谱条件测定，HPLC色谱图见图1 。

将不同产地不同等级的天麻以“2.1.3 ”项下色谱条件进行含量测定，计算出不同产地不同等级天麻中天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、B、C、E 6种指标成分的含量，均符合2020版《中华人民共和国药典》项下含量要求，其平均值依次为(0.59±0.22)%，(0.08±0.04)%，(1.40±0.44)%，(0.63±0.15)%，(0.12±0.04)%，(1.92±0.60)%。

2.4.2近红外光谱采集 在“2.2”项下近红外光谱测定条件下，采集66批次不同产地不同等级的近红外光谱，重复测定4次，平均光谱见图2。

2.4.3校正集和验证集划分 应用TQ Analyst 8.0版软件，由计算机从66份样品中随机挑选出60份不同批次的天麻样品建立天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、B、C、E的近红外定量校正模型，见表2。验证集样品中天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、B、C、E 含量均在校正集含量范围内，此校正集与验证集可用于建模。

1.天麻素；2.对羟基苯甲醇；3.巴利森苷E；4.巴利森苷B；5.巴利森苷C；6.巴利森苷A。

2.4.4波段选择 采用TQ Analyst软件自带的优化设置，筛选出最佳建模波段为950.00～1650.00 nm。

2.4.5NIR光谱预处理 在NIR分析中，常用多元校正方法包括：多元线性回归(MLR)、主成分回归法(PCR)、偏最小二乘回归法(PLSR)等线性校正方法。本实验采用PLS作为校正方法，以相关系数(R)，校正均方差(RMSEC)，预测均方差(RMSEP)为模型性能评价指标，考察标准正态变换(SNV)，多元散射校正(MSC)，平滑去噪法(Narris derivative filt和Savitzky-Golay卷积平滑法)，一阶导数法(1stderivative，1stD)，二阶导数法(2ndderivative，2ndD)等预处理方法。其中R越接近1，RMSEC和RMSEP越接近0，模型的性能越稳定。本实验比较SNV和MSC等预处理方法对天麻6种指标性成分定量模型的影响，见表3。综合考虑天麻素采用SNV+1stD组合方案进行预处理，对羟基苯甲醇采用MSC方案进行预处理，巴利森苷A和B采用BSC+1stD组合方案进行预处理，巴利森苷C和E采用MSC+2ndD+N-D平滑组合方案进行预处理。

图2 66份天麻样品的近红外原始光谱叠加

2.4.6主成分数的选择 主成分数的选择影响NIR定量分析模型的稳定性和预测性。定量分析模型以校正集样本的内部交叉验证均方差(Root mean square error of cross validation，RMSECV)为评价指标，当RMSECV最小时，所选主成分数最佳。本研究中天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、B、C、E定量模型最佳主因子数分别为8，7，8，8，9，5，RMSECV依次为0.190 6%，0.030 9%，0.198 0%，0.127 9%，0.026 8%，0.238 7%。

2.4.7定量模型的建立与评价 运用TQ数据分析软件，采用偏最小二乘法PLS算法，建模波长为950～1650.00 nm，天麻素和对羟基苯甲醇分别采用SNV+1stD和MSC光谱前处理方法，巴利森苷A和巴利森苷B采用MSC+1stD组合方案进行预处理，巴利森苷C和E采用MSC+2ndD+N-D平滑组合方案进行预处理。天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C和巴利森苷E定量模型最佳主因子数分别为8，7，8，8，9，5；模型质量评价参数R依次为0.984 1，0.906 3，0.985 8，0.985 7，0.985 2，0.950 6；RMSEC依次为0.042 7%，0.017 0%，0.074 9%，0.026 9%，0.008 0%，0.136 0%；RMSEP依次为0.083 7%，0.011 6%，0.138 0%，0.069 9%，0.014 5%，0.178 0%；上述天麻6种有效成分定量模型相关系数R值均接近于1，RMSEC值和RMSEP 值均接近于0，即说明天麻6种有效成分定量模型预测性能稳健且准确性高。天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C和巴利森苷E的NIR预测值与真实值相关性见图3。

表2 校正集与验证集样品测定值

表3 不同预处理对6种成分定量模型的影响

A.天麻素；B.对羟基苯甲醇；C.巴利森苷A；D.巴利森苷B；E.巴利森苷C；F.巴利森苷C。

2.4.8定量模型验证 定量模型建立后，选择6个未参加建模的样品进行外部验证，验证结果见表4。天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E指标预测值和HPLC测定的真实值分别见表6。通过统计学分析，说明模型稳定性和准确性较好，可以用于天麻饮片6种主要有效成分的含量预测。经配对t检验，6个验证集样本的HPLC法测定的真实值与NIR光谱预测值的配对t检验值都小于t(0.05，6)=4.032，即两者分析方法的分析结果差异无统计学意义，表明该这6种成分预测模型可用于天麻样品6种成分的含量测定。

表4 天麻6种成分模型预测值与HPLC测定真实值

3 讨论

笔者在本实验为了体现中药的整体性和化学成分的多样性，以安徽金寨和陕西汉中多个县市的天麻为研究对象，采用主成分分析PCA和偏最小二乘法PLS等算法，建立不同产地不同等级天麻的天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C和巴利森苷E 6种指标性成分的定量校正模型，并对未参与建模的6批次样品进行预测，对结果进行配对t检验，显示预测值与真实值之间差异无统计学意义，表明本文所采用的NIR法与HPLC法之间没有明显的系统误差。

目前天麻的质量控制主要采用HPLC法进行检测，该方法虽然检测准确，但样品前处理繁琐，耗时较长，本研究建立天麻6种指标成分的定量校正模型，模型稳定可靠，可用于对未知样品的预测。与HPLC法比较，能快速简便准确地预测不同产地不同等级的天麻中天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 6种指标性成分含量，大大缩短检测时间，并节省检测成本，减少环境污染，可实现天麻工业大生产中的快速检测和在线质量监控，为后期建立天麻质量品质的数字化和智能化提供参考。