高效液相色谱法测定槟榔中4种细胞毒性生物碱

黄 喜

（邵阳市食品药品检验所，湖南 邵阳 422000）

槟榔为棕榈科植物槟榔（Areca catechuL.）的干燥成熟种子，主要分布于我国南方及东南亚等地，收载于《中国药典》，具杀虫、消积、行气、利水、截疟等功效[1]。临床用于治疗肥胖症、绦虫病、小儿疳积、腹胀便秘、肝硬化腹水等疾病[1-2]。通过化学成分分析，已从槟榔中分离得到生物碱、鞣质、黄酮、萜类等60多种不同类别化合物[2]。槟榔碱可兴奋M-胆碱受体，有增加肠蠕动、灭螺、驱虫的作用[3]。槟榔次碱兴奋M-胆碱受体，并结合脑部γ-氨基丁酸受体，阻断神经抑制作用，产生抗抑郁作用[4]。现代药理研究表明，槟榔有多种毒性甚至细胞毒性，对人体的心血管、神经、胃肠道、代谢、呼吸系统和生殖系统有一定影响[5-7]。2003年国际癌症研究中心（IARC）认定槟榔为一级致癌物[8]，食用槟榔的人群患口腔癌的风险增加[9]。Marques在《柳叶刀肿瘤学》发表了槟榔碱致癌性主要评估结论，槟榔碱被定为2B类致癌物[10]。槟榔碱可诱导细胞程序性或非程序性死亡[11]，对PC12细胞具有神经毒性作用[12]。槟榔碱是槟榔成瘾性的主要成分，与吗啡同用能增强吗啡的成瘾性[13]。槟榔能使雄性小鼠精子数目减少、活性降低，能抑制胚胎细胞生长发育[14]。

生物碱是槟榔毒性与药效兼具的活性成分，其中槟榔碱、去甲槟榔碱、槟榔次碱和去甲槟榔次碱等4 种化合物占槟榔总生物碱90 %以上[15-16]，既是槟榔主要药理活性物质，也是槟榔主要毒性物质。因此建立一种简单方便、科学经济的方法测定这4种物质很有必要。《中国药典》2020年版用高效液相色谱法测定槟榔中槟榔碱1种组分的含量[1]，其他文献大多测定槟榔碱、槟榔次碱中1种或2种成分，鲜有同时测定4种生物碱含量的报道[17-18]，现有文献均使用强阳离子交换键合硅胶为填充剂（SCX-强阳离子交换柱），存在经济成本高、使用寿命短、维护保养难、重现性差等不足。本研究尝试通过优化样品溶液制备方法与色谱系统，选择实验室常规使用的C18柱，同时测定槟榔碱、去甲槟榔碱、槟榔次碱和去甲槟榔次碱等4 种细胞毒性生物碱，以期为槟榔质量控制提供更经济、简便、准确的技术方法。

1 仪器与试药

Waters e2695高效液相色谱仪、自动进样器、PDA检测器（美国，沃特世公司）；ME204电子天平（瑞士，梅特勒-托利多）。

氢溴酸槟榔碱对照品、去甲槟榔碱对照品、槟榔次碱盐酸盐对照品、去甲槟榔次碱盐酸盐对照品（含量：≥98.0 %，成都瑞芬思生物科技有限公司）；甲醇（色谱纯，国药集团）；磷酸氢二铵、磷酸、氨水、甲醇（分析纯，国药集团）；超纯水由实验室自制。

槟榔样品由湖南皇爷食品有限公司提供，产地为海南，采摘新鲜成熟果实，晒干，未经其他工艺加工或炮制，共3批，经本实验室鉴定均为棕榈科植物槟榔。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流动相：甲醇-0.05 mol/L磷酸氢二铵溶液（用1 % 磷酸溶液或氨试液调节pH值6.8～7.0）（63:37，v:v）; 流速：1.0 ml/min；检测波长：215 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μl。

2.2 对照品溶液的配制

精密称取氢溴酸槟榔碱对照品37.56 mg（槟榔碱重量=氢溴酸槟榔碱重量/1.5214）、去甲槟榔碱对照品24.85 mg、槟榔次碱盐酸盐对照品31.36 mg（槟榔次碱重量=槟榔次碱盐酸盐重量/1.2583）、去甲槟榔次碱盐酸盐对照品32.26 mg（去甲槟榔次碱重量=去甲槟榔次碱盐酸盐重量/1.2868）置入25 ml量瓶，加甲醇适量超声溶解，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品贮备液（4种组分质量浓度各约为1 mg/ml）。精密量取贮备液0.1，0.5，1，2，5，10 ml，分别置入20 ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度约为5，25，50，100，250，500 μg/ml的系列混合对照品工作溶液。

2.3 样品溶液的制备

取样品粉碎成细粉（过80目筛），称取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氨试液2 ml，轻轻摇匀，静置15 min，使粉末充分浸润，加乙醚100 ml，加热回流，调节温度保持微沸1 h，取出，放冷，滤过，滤液置入加有1 % 磷酸溶液1 ml的蒸发皿；锥形瓶及残渣用乙醚少量多次洗涤，合并乙醚液，挥干，残渣加流动相溶解，转移至25 ml量瓶，加流动相稀释至刻度，摇匀，用0.25 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。在上述色谱条件下，色谱图分别见图1，峰形对称，与其他组分能完全分离。

图1 槟榔中4种生物碱HPLC色谱图

2.4 线性范围与检测限

取系列混合对照品工作溶液，照2.1项下色谱条件测定4个组分的峰面积，以质量浓度（μg/ml）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表1。槟榔碱、去甲槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔次碱4种组分在浓度约为5～500 μg/ml范围内线性关系良好，相关系数R均大于0.999。以信噪比S/N=3计算检出限，S/N=10计算定量限，4种组分线性范围与检测限见表1。

表1 4种生物碱线性范围与检测限（n=6）

2.5 加标回收率

精密称取已测定含量的槟榔样品约0.5 g，精密加入浓度约为100 μg/ml的混合对照品溶液1 ml，按2.3项样品溶液制备方法和2.1项色谱条件测定，计算回收率，回收率%=（测得量-样品中含量）÷标准加入量×100 %，平行测定6份，结果见表2。结果表明，4种待测组分回收率均良好。

表2 回收率试验结果（n=6）

2.6 精密度试验

取同一份混合对照品溶液连续进样5次，以5次的峰面积计算RSD，结果槟榔碱、去甲槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔次碱的RSD分别为0.5 %，0.9 %，0.7 %，0.7 %（n=5），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取同一份样品溶液分别在制备后0，4，8，16，24，48 h进样，以峰面积计算相对标准偏差，结果槟榔碱、去甲槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔次碱的RSD分别为1.0 %，1.1 %，2.0 %，1.9 %（n=6），表明样品溶液在48 h内稳定。

2.8 耐用性试验

保持2.1项下其他色谱条件不变，分别改变以下4个条件：（1）色谱柱分别选用Agilent ZORBAX C18、Waters SunFire C18、Shimadzu Inertsil ODS-SP C18；（2）流动相中甲醇比例分别调节为57 %，60 %，63 %，66 %，69 %；（3）流动相pH值分别调节为6.6，6.8，7.0，7.2；（4）柱温分别设置为20，25，30，35，40 ℃。结果均有良好的重现性，峰形对称，与其他组分能完全分离，表明色谱条件细微改变，该法均保持良好的耐用性。

2.9 样品测定

取3批样品，照2.3项样品溶液制备方法和2.1项色谱条件，测定槟榔碱、去甲槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔次碱的含量，每批样品平行测定3份，计算平均含量，结果见表3。结果表明，槟榔中生物碱成分主要是槟榔碱，约占所测4种组分总量的50 %。

表3 样品测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 流动相的优化

3.1.1 流动相pH值选择 用1 %磷酸溶液或氨试液分别调节流动相pH值为4.0±0.05，5.0±0.05，6.0±0.05，6.5±0.05，7.0±0.05，7.5±0.05，8.0±0.05，8.2±0.05，其他色谱条件不变，用同一份混合对照品溶液进样。结果pH值6.0～7.5时峰形良好；pH值6.0以下时，色谱峰出现拖尾；pH值越低，拖尾越严重。4种待测化合物分子结构中均含有氢化吡啶环，显弱碱性，强酸性条件下能接受质子呈离子态；槟榔次碱与去甲槟榔次碱分子中含羧基，整体呈现酸碱两性，在强碱性条件下失去质子呈离子态；槟榔碱与去甲槟榔碱均含羧酸甲酯结构，强酸或强碱条件下，酯键容易断裂呈羧酸根离子；同时考虑大部分色谱柱对pH值的耐受性，调节流动相pH值6.8～7.0，在此条件下，色谱图见图1 A，4个组分色谱峰对称因子均为0.95～1.05，保留时间5～16 min。

3.1.2 磷酸氢二铵浓度选择 流动相水相使用磷酸氢二铵溶液，并调节溶液pH值，起到缓冲作用，保持流动相pH值稳定。配制磷酸氢二铵浓度分别为0.001，0.005，0.01，0.03，0.05，0.08，0.1 mol/L，其他色谱条件不变，用同一份混合对照品溶液各进样10次。当磷酸氢二铵浓度在0.01 mol/L以下时，各组分保留时间变化范围较大，同一组份10次进样的保留时间漂移（保留时间最大值与最小值之差）超过0.5 min，10次保留时间RSD为1.5 %～4.0 %。当浓度0.03 mol/L以上时各组分保留时间变化范围较小，10次的保留时间漂移在0.3 min以内，保留时间RSD在1.0 %以下。可见流动相缓冲盐浓度过低，缓冲作用减弱，色谱系统稳定性降低；同时考虑缓冲盐浓度过高，容易析出盐分堵塞液相色谱仪管路，因此选择0.05 mol/L的磷酸氢二铵溶液。

3.2 样品前处理方法研究

3.2.1 提取方法研究 方法（1）碱性乙醚提取法：按2.3项下方法制备样品溶液，结果见图1 B。方法（2）酸性水提取法：以稀盐酸调节pH值至3.5的蒸馏水为溶剂回流提取，滤过，容器与滤渣用pH 3.5的蒸馏水分次洗涤，合并滤液与洗液，蒸至近干，用流动相稀释至25 ml，结果见图1 C。由图1可见，方法（1）提取的样品其他组分较少，4种待测组分与其他成分完全分离，没有干扰。方法（2）提取的样品则有大量其他组分干扰，其中1号目标峰（去甲槟榔次碱）与2号目标峰（去甲槟榔碱）与其他组分不能完全分开，干扰严重。在酸性条件下，槟榔中大量水溶性成分被提取出来，干扰了待测成分准确测定，但也提示，在进一步进行槟榔成分研究时，可参考酸性水提法。

3.2.2 加氨顺序考察 试验中发现加氨试液顺序对样品中待测组分提取效果有较大影响，因此考察两种方法：方法（1）先加氨法：样品先加适量氨试液，充分浸润后，后加乙醚回流提取，即2.3项下方法。方法（2）后加氨法：样品先加乙醚，后加氨试液，其余同2.3项下。取同一批样品共10份，其中5份按方法（1）制备，进样测定，计算各组分含量平均值及RSD；另5份按方法（2）制备，进样测定，计算各组分含量平均值及RSD，结果见表4。样品4种组分平均含量方法（1）明显高于方法（2），且RSD较低；进行F检验（α=0.05），结果均存在显著性差异。可见先加碱充分浸润样品粉末，有助于乙醚将待测组分从植物组织中提取出来。

表4 两种方法提取结果

3.2.3 回流时间考察 回流时间分别为15，30，45，60，90，120 min，其余按2.3项下方法，取同一批样品，每个时间段平行测定3份样品，以3份样品含量的平均值为纵坐标，回流时间为横坐标，绘制曲线图，见图2。从图2可见，回流60 min，4种组分基本提取完全。

图2 槟榔中4种生物碱回流提取结果

综上，本文建立的槟榔中细胞毒性生物碱提取和含量测定方法简单快速，定量准确，可同时测定槟榔中槟榔碱、去甲槟榔碱、槟榔次碱和去甲槟榔次碱等4种细胞毒性生物碱的含量，可用于槟榔质量控制，提高槟榔安全性；使用常规C18色谱柱，可减轻企业负担，提高经济效益。