运动训练对缺血性脑卒中大鼠认知障碍的改善作用及机制研究

赵幸娜，李和平，郭景花

脑卒中(stroke)是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病，主要分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中两种类型，缺血性脑卒中病人占脑卒中病人总人数的80%左右[1]。研究表明，缺血性脑卒中的幸存者中有30%的人会发展为立即或延迟性的认知障碍，其执行能力、注意力、语言能力、记忆力等方面均出现不同程度的下降或损害，严重影响病人生存质量，给家庭带来较大的经济负担[2-3]。氧化应激反应是脑卒中后脑损伤的重要机制之一，也是影响病人预后的重要因素[4]。NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)和抗氧化反应元件(antioxidant response elements，ARE)是抗氧化应激反应的重要调节因子，活化的Nrf2可以进入细胞核与ARE结合，而Nrf2和ARE的激活可以增加乙二醛酶(glyoxalase 1，Glo-1)的表达水平，进一步调控细胞代谢、氧化还原和凋亡等过程，并参与阿尔茨海默病、帕金森病、糖尿病、脑卒中等多种氧化应激相关疾病的发展过程[5-7]。当前的临床研究发现，运动康复疗法可以提高病人神经系统的反应和兴奋性，促进大脑皮质功能重组，最终提高脑卒中病人的运动功能，改善病人的认知障碍，但其具体作用机制尚不明确[8]。因此，本研究通过建立缺血性脑卒中大鼠模型，检测大鼠认知功能变化、氧化应激水平和海马Nrf2、ARE和Glo-1蛋白表达，探讨运动训练对脑卒中大鼠认知障碍的改善作用及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级SD大鼠30只，6周龄，体质量180～220 g，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2017-0011。大鼠提前饲养于动物房内进行为期1 周的适应性饲养，室温(22±2)℃，湿度(50±10)%，每天定时换气，保持12 h∶12 h光暗照明，食水不限。实验动物及饲养条件符合《实验动物管理条例》要求。

1.1.2 药物与试剂 水合氯醛购自天津市科密欧化学试剂有限公司；青霉素购自华北制药股份有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、一氧化氮(nitric oxide，NO)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所有限公司；Nrf2、ARE、Glo-1、β-actin兔源单克隆抗体及羊抗兔二抗均购自美国CST公司；RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、脱脂奶粉、增强型化学发光试剂(ECL)发光液、聚偏二氟乙烯(PVDF)转印膜、Trizol试剂均购自北京索莱宝科技有限公司；亚细胞结构胞核与胞浆蛋白抽提试剂盒购自武汉博士德生物工程公司；蛋白定量试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；Marker购自SMOBiO公司。

1.1.3 仪器 小动物解剖台(上海化科实验器材有限公司)；DSPT-202型电动跑台(杭州立泰生物科技有限公司)；RM2245切片机(德国徕卡)；Multiskan MK3酶标仪(Thermo Fisher Scientific)；IX53显微镜(日本奥林巴斯)；TGL16MB高速冷冻离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)；DYCZ-24KS型双板垂直电泳仪(北京六一仪器厂)；G：BOX多功能凝胶成像系统(Syngene)；AE223电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；MET VX200-T型涡旋振荡器[施锐(上海)贸易有限公司]；DW-86L626超低温冰箱(海尔集团)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与脑卒中模型建立 将30只大鼠随机分为假手术组、模型组和运动组，每组10只。除假手术组外，模型组和运动组采用线栓法构建大鼠脑卒中模型。模型组和运动组大鼠逐只称重，采用10%的水合氯醛溶液腹腔注射对大鼠进行麻醉，麻醉剂量为100 g体重0.35 mL。麻醉完毕，将大鼠以仰卧位固定于手术台上，颈部备皮，75%乙醇消毒，在大鼠颈部正中作一1.5～2.0 cm的切口，剥离周围组织、小血管和神经，暴露右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，将右侧颈总动脉和颈外动脉结扎，并在颈总动脉结扎的近心端备活结，在颈总动脉结扎线和活结中间剪一个切口，将多聚赖氨酸包被的栓线插入切口，缓慢推入大脑中动脉起点处(深度18～22 mm)，随后将颈总动脉活结打成死结，剪去多余栓线，缝合切口，并对缝合区消毒。假手术组大鼠仅剥离组织和暴露血管，不进行结扎和插入栓线处理。术后各组大鼠分笼饲养，给予适量青霉素抗感染，注意保暖，苏醒后正常给予食物和水饲养。造模2 h后，采用Longa法进行神经功能缺损评分，筛选造模成功大鼠。评分标准：0分为无神经损伤症状；1分为对侧前爪不能完全伸展；2分为行走时向外侧转圈；3分为行走时向外侧倾倒；4分为不能自发行走，意识丧失；5分为死亡。神经功能缺损评分为1～3分视为建模成功，纳入本次实验。模型组和运动组中造模成功的大鼠均为9只，实验过程中模型组大鼠死亡1只，运动组大鼠无死亡。

1.2.2 运动训练 电动跑台模拟人跑步运动，可设置运动速度和时间，其尾部的电栅栏可电击刺激大鼠尾部以保证大鼠按照设定的速度主动跑动。在脑卒中模型建立前1周，以10 m/min、5 min/d的运动量对大鼠进行适应性运动训练。脑卒中模型建立24 h后，开始对大鼠进行运动训练，每天训练30 min，并逐渐增加运动强度。第1天、第2天：5 m/min运动10 min，10 m/min运动10 min，15 m/min运动10 min；第3天、第4天：5 m/min运动5 min，10 m/min运动5 min，15 m/min运动20 min；第5天：15 m/min运动30 min，之后每天按照15 m/min运动30 min的运动强度对大鼠进行运动训练，直至实验结束。假手术组和模型组大鼠不进行跑台运动训练。

1.2.3 学习记忆能力检验 在跑台运动训练8周后，通过Morris水迷宫实验检测各组大鼠的学习记忆能力。第1天至第5天进行定位航行实验：随机选取一个象限作为起始象限，将大鼠头部朝向池壁放入水中，记录大鼠从入水开始到找到隐藏在水面下的平台的时间，即逃避潜伏期(escape latency)；若时间超过90 s，则将大鼠引至平台，并使大鼠在平台停留20 s以引导其学习记忆，该次逃避潜伏期记录为 90 s。一次实验结束后，将大鼠身上水分擦干，吹风机吹干后放回笼内。4个象限均需完成定位航行实验，每次实验间隔15 min，重复5 d。第6天进行空间探索实验：移去水迷宫中的平台，将大鼠从先前平台的对侧象限放入水中，记录90 s内大鼠穿越过平台位置的次数和在该目标象限中所占时间百分比。

1.2.4 血清SOD活性、MDA和NO含量测定 Morris水迷宫实验结束后，用10%水合氯醛对各组大鼠进行麻醉，腹主动脉穿刺取血，每只大鼠可取血约8 mL，分装在EP管中，置于4 ℃冰箱静置4 h，4 ℃环境下3 000 r/min离心10 min，离心半径为12.5 cm。离心完毕后吸取上层血清，分装在EP管中，-80 ℃保存。①SOD活性检测：取待测样品20 μL，依次加入SOD检测缓冲液、WST-8工作液和反应启动工作液，37 ℃孵育30 min，450 nm波长测定吸光度(A)值，计算抑制百分率，抑制百分率=(△A空白-△A测定) /△A空白×100%，待测样品的SOD酶活性(U/mL)=[抑制百分率/(1-抑制百分率)×反应体系总体积]/样品体积×稀释倍数。②MDA含量检测：取待测样品100 μL，依次加入工作液、蒸馏水和待测样品，置于100 ℃水浴中孵育60 min，冰浴冷却，10 000 g常温离心10 min，吸取200 μL上清液加入玻璃比色皿中，测定各样品在450 nm、532 nm和600 nm处的吸光度A值，计算△A450=A450测定-A450空白，△A532=A532测定-A532空白，△A600=A600测定-A600空白，MDA含量(μmol/L)=5×[12.9×(△A532-△A600)-2.58×△A450]。③NO含量检测：取待测样品100 μL，依次加入蒸馏水、标准液、待测样品和工作试剂一，混合均匀后在37 ℃水浴60 min，再加入工作试剂二，混匀后室温静置5 min，3 500 r/min离心10 min，取上清液100 μL，然后各个反应孔加入显色液100 μL，混匀后在550 nm下测定吸光度A值，计算△A标准=A标准-A空白，△A测定=A测定-A空白，绘制标准曲线，计算NO的含量。

1.2.5 蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测海马组织Nrf2、ARE和Glo-1蛋白表达 取各组大鼠海马组织0.1 g，冰上研磨匀浆后按照蛋白提取试剂盒说明书提取胞浆和胞核蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，定量完毕后蛋白中加入上样缓冲液(loading buffer)，在EP管中混匀，置于沸水中煮沸5 min使蛋白变性。随后配制15%的分离胶和5%的浓缩胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，上样后80 V电泳2 h，60 V转膜2 h，5%脱脂奶粉封闭2 h，将PVDF膜放入10 mL兔源一抗稀释液中，一抗分别为：Nrf2(1∶2 000)、ARE(1∶2 000)、Glo-1(1∶2 000)。PVDF膜在一抗稀释液中4 ℃过夜，第2天用TBST缓冲液清洗3次，每次10 min，然后加入羊抗兔二抗(1∶1 000)，37 ℃孵育2 h，TBST缓冲液清洗3次后滴加ECL发光液，反应1 min后置于凝胶成像系统显影。免疫印迹实验的内参蛋白为β-actin，用Image J软件分析各个蛋白对应的灰度值，计算蛋白的相对表达量，蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

2 结 果

2.1 运动训练对脑卒中大鼠学习记忆能力的影响 Morris水迷宫实验结果显示，在定位航行实验中，与假手术组比较，模型组第1天、第3天、第5天逃避潜伏期明显延长，与模型组比较，运动组第1天、第3天、第15天逃避潜伏期明显缩短，差异均有统计学意义(P<0.05)。在空间探索实验中，模型组穿越过平台位置次数和在目标象限中所占时间百分比均明显低于假手术组，与模型组大鼠比较，运动组大鼠穿越过平台位置次数和在目标象限中所占时间百分比均明显增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1、表2。

表1 各组大鼠定位航行实验逃避潜伏期比较(±s) 单位：s

表2 各组穿过平台位置次数和在目标象限中所占时间百分比比较(±s)

2.2 运动训练对脑卒中大鼠血清SOD活性、MDA和NO含量的影响 与假手术组比较，模型组血清SOD活性明显降低，与模型组比较，运动组血清SOD活性则明显增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。与假手术组比较，模型组血清MDA和NO含量明显增加，与模型组比较，运动组血清MDA和NO含量明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠血清SOD活性、MDA和NO含量比较(±s)

2.3 运动训练对脑卒中大鼠海马组织Nrf2、ARE和Glo-1表达水平的影响 与假手术组比较，模型组大鼠海马组织细胞质和细胞核中Nrf2的蛋白表达水平无明显变化，差异均无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，运动组大鼠海马组织细胞质中Nrf2蛋白表达水平减少，而细胞核Nrf2蛋白表达水平明显增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。与假手术组比较，模型组大鼠海马组织中ARE、Glo-1蛋白表达水平降低，与模型组比较，运动组大鼠海马组织中ARE、Glo-1蛋白表达水平明显增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图1、表4。

图1 各组大鼠海马组织Nrf2、ARE和Glo-1表达水平条带图

表4 各组大鼠海马组织Nrf2、ARE和Glo-1蛋白相对表达量比较(±s)

3 讨 论

缺血性脑卒中是临床常见的脑血管疾病之一，根据发病时所累及血管的不同，病人呈现的症状也不同，主要临床表现为肢体无力和麻木、口眼歪斜、语言功能障碍和理解能力降低，若不及时治疗可能造成病人死亡[9]。临床用于治疗缺血性脑卒中的方法包括使用溶栓药、抗栓药和神经保护制剂、机械取栓等，其中机械取栓是近年来最有效的治疗方法之一，但仍有约1/3的病人术后尚不能恢复功能独立性，2/3的病人伴有认知障碍[10-11]。多项研究证明，运动训练可以改善缺血性脑卒中病人的认知能力、心血管功能，防止关节挛缩和痉挛，是缺血性脑卒中病人康复治疗的重要环节，但其潜在作用机制尚不清晰[12-13]。因此，本研究构建了缺血性脑卒中大鼠模型，探究运动训练对缺血性脑卒中大鼠认知障碍的改善作用及作用机制。

本研究结果显示，在Morris水迷宫实验的定位航行实验中，与假手术组比较，模型组第1天、第3天、第5天逃避潜伏期明显延长，与模型组比较，运动组第1天、第3天、第15天逃避潜伏期明显缩短；在空间探索实验中，与假手术组比较，模型组穿越过平台位置次数和在目标象限中所占时间百分比均明显降低，与模型组比较，运动组大鼠穿越过平台位置的次数和在目标象限中所占时间百分比均明显增加，表明运动训练提高了缺血性脑卒中大鼠的空间学习记忆能力。氧化应激反应是缺血性脑卒中后脑损伤的重要机制之一，也是影响病人预后的重要因素，其中，SOD是重要的氧自由基清除剂，MDA是脂质过氧化反应的终产物，另外，脑缺血可激活一氧化氮合酶(NOS)，使NO过量合成，导致神经元缺血坏死[14-16]。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组血清SOD活性明显降低，MDA和NO含量明显增加；与模型组比较，运动组血清SOD活性明显增加，MDA和NO含量明显降低，表明运动训练可以减少大鼠缺血性脑卒中后氧化应激损伤，对脑组织产生保护作用。

Nrf2是目前已知的最重要的内源性抗氧化应激转录因子，可通过与ARE相互作用调节体内氧化应激反应，对骨骼肌、心、脑、肾和肝脏等器官发挥保护作用[17]。Glo-1是α-羰基醛代谢的主要限速酶，能够将具有细胞毒性的甲基乙二醛转化为无毒的乳酸盐，抑制晚期糖基化终产物的生成，使机体免受细胞毒和糖基化损伤，在糖尿病、高血压、焦虑、抑郁、记忆和认知障碍中具有重要调节作用[18-19]。目前，运动对Nrf2活性及蛋白表达的影响已在许多研究中得到证实。Monir等[20]研究发现，强制运动训练可激活大鼠纹状体中的Nrf2信号通路，明显改善帕金森病大鼠的运动能力和行为表现。王蒙等[21]研究认为，高强度间歇运动可通过激活Nrf2/ARE途径提高机体抗氧化能力，并减弱氧化应激损伤。申梦丽等[22]研究证明，游泳训练能够上调大鼠海马中Nrf2、ARE的表达，增强Glo-1的功能，从而对抗氧化应激，改善糖尿病大鼠的认知能力。因此，运动训练可能通过上调Nrf2、ARE、Glo-1表达改善缺血性脑卒中大鼠认知障碍。本研究通过Western Blot法检测各组大鼠海马组织Nrf2、ARE和Glo-1蛋白表达水平，结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠海马组织中细胞质和细胞核中Nrf2的蛋白表达水平无明显变化，但ARE、Glo-1蛋白表达水平降低；与模型组比较，运动组大鼠海马组织细胞质中Nrf2蛋白表达水平减少，而细胞核Nrf2、ARE、Glo-1蛋白表达水平明显增加，表明运动训练可以促使细胞质中的Nrf2进入细胞核与ARE结合，增强Glo-1蛋白表达，产生抗氧化应激作用。

综上所述，运动训练可以有效改善脑卒中大鼠认知障碍，提高脑卒中大鼠空间学习记忆能力和抗氧化能力，其作用机制可能与增加Nrf2、ARE和Glo-1蛋白表达有关。但本研究由于样本量小，仅在运动训练8周后检测了大鼠空间记忆能力及其他相关指标检测，未能呈现缺血性脑卒中及运动训练干预后各项指标的动态变化。