斑地锦及近缘种的HPLC 指纹图谱鉴别研究

侯 静，黎 理，景晓彤，梁 圆，韦珊珊，蔡 毅

（广西中医药大学药学院，南宁 530001）

斑地锦（Euphorbia maculataL.）作为地锦草药材之一，收载于2015 年版《中国药典》［1］，具有清热解毒、凉血止血、利湿退黄等功效，可用于治疗痢疾、尿血、崩漏、疮疖痈肿等疾病。斑地锦主要含槲皮素、山奈酚等标志性成分，具有保肝、治疗宫颈癌、抗肿瘤抗高血糖、抑制胃癌细胞的增殖、抗骨质疏松及抗细胞毒性等药理活性［2-13］。地锦组植物有10 个种，其中广西壮族自治区（以下简称广西）分布有5个种［14，15］，其形态相近、混生，药材性状极为相似，显微特征基本相同，不易区分，在民间常将斑地锦与近缘种匍匐大戟（Euphorbia prostrataAit.）、千根草（Eu-phorbia thymifoliaL.）、台西地锦［Euphorbia taihsiensis（Chaw et Koutnik）Oudejians］混合使用［16］，品种使用比较混乱。本研究采用HPLC 指纹图谱的方法，对常见的几种地锦草组植物进行鉴别研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 Waters 2695 型高效液相色谱仪（2988 PDA 检测器），赛智科技有限公司；AEG-220 型电子分析天平，日本岛津公司；KQ5200B 型超声波清洗器（40 kHz、250 W），昆山市超声仪器有限公司。

1.1.2 试药 对照品槲皮素（批号100081-201610）、山奈酚（批号110861-202013），质量分数大于98%，中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，Merk 公司；甲醇为分析纯，水为去离子水。

1.1.3 药材 10 批斑地锦药材和20 批近缘种均采集于广西，经广西中医药大学中药鉴定教研室蔡毅教授鉴定为斑地锦、匍匐大戟、千根草、台西地锦，样品来源见表1。

表1 斑地锦和近缘种样品来源

1.2 方法

1.2.1 供试品溶液的制备 分别取30 批药材粉末（过3 号筛）约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇-10%HCl（4∶1）10 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用乙醇-10%HCl（4∶1）补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

1.2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取槲皮素、山奈酚对照品适量，分别置于不同量瓶中，加乙醇-10%HCl（4∶1）适量，超声使溶解，放冷，加乙醇-10%HCl（4∶1）定容至刻度，制得质量浓度分别为0.4～0.7 mg/mL 的对照品溶液，经 0.45 μm 微孔滤膜过滤，密封，低温避光保存，备用。

1.2.3 色谱条件 采用PBONTOSIL KROMAPLUS 100-5-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱程序见表2；体积流量为0.8 mL/min；检测波长360 nm；柱温25 ℃；进样量10 μL。

表2 梯度洗脱程序

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 精密度试验 取斑地锦药材（S1）制备成供试品溶液，按照“1.2.3”的色谱条件连续进样6 次，记录色谱峰。以槲皮素色谱峰（1 号峰）为参照峰，结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.63%，相对峰面积的RSD均小于1.43%，说明该方法精密度良好。

2.1.2 重复性试验 取斑地锦药材（S1）的粉末6份，按照“1.2.1”的方法制备供试品溶液，按照“1.2.3”的色谱条件记录色谱峰。以槲皮素色谱峰（1 号峰）为参照峰，结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.85%，相对峰面积的RSD均小于1.04%，表明该方法重复性良好。

2.1.3 稳定性试验 取斑地锦药材（S1）制备成供试品溶液，按照“1.2.3”的色谱条件，分别在 0、4、8、12、16、24 h 进样，记录色谱峰。以槲皮素色谱峰（1 号峰）为参照峰，结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.38%，相对峰面积的RSD均小于1.63%，说明样品稳定性良好。

2.2 HPLC 指纹图谱的建立

2.2.1 指纹图谱建立及评价 取10 批斑地锦及其近缘种样品，按照“1.2.1”和“1.2.2”的方法制备对照溶液及供试品溶液，按照“1.2.3”的条件，进样分析。斑地锦及近缘种匍匐大戟、千根草、台西地锦在120 min 内分别有 13、11、10、12 个共有峰，叠加图谱分别见图1 至图4，共有模式图谱见图5。

图1 10 批斑地锦HPLC 特征图谱叠加效果

图4 6 批台西地锦样品HPLC 特征图及谱叠加效果

图5 斑地锦及近缘种的共有模式

图2 8 批匍匐大戟样品HPLC 特征图谱叠加效果

图3 6 批千根草样品HPLC 特征图谱叠加效果

2.2.2 特征峰的标定和比对 根据10 批斑地锦的指纹图谱（A）检测结果，共标定2 个特征峰（图6）。经过与对照品保留时间比对，可知1 号峰为对照品槲皮素，2 号峰为对照品山奈酚。

图6 特征峰的标定和比对

2.2.3 相似度比较分析 对10 批斑地锦、8 批匍匐大戟、6 批千根草、6 批台西地锦样品进行相似度比较分析（表3），结果其相似度分别大于0.916、0.884、0.979、0.939，相似度良好。

表3 30 批斑地锦及其近缘种相似度评价结果

2.2.4 聚类分析 采用SPSS 21.0 分析软件，以组之间链接及平方Euclidean 距离方法，对30 批样品进行系统聚类分析。结果不同种可分为4 类（图7），S1至 S10 聚为第一类，S25 至 S30 聚为第二类，S11 至S18 聚为第三类，S19 至 S24 聚为第四类。

图7 30 批样品指纹图谱聚类分析

2.2.5 主成分分析（PCA） 采用SPSS 21.0 分析软件对30 批样品，以主成分的方差贡献率为及特征值为依据，进行主成分分析，结果S11 至S18 样品聚为一类，S19 至 S24 样品聚为第二类，S1 至 S10 和 S25 至S30 样品分别聚为2 类，且样品点距离较近（图8）。

图8 30 批样品指纹图谱主成分分析

3 小结

本研究建立了斑地锦及其近缘种HPLC 指纹图谱，斑地锦有13 个特征峰，匍匐大戟、千根草、台西地锦分别有11、10、12 个特征峰，色谱峰具有明显区别，并指认出2 个特征峰，分别为槲皮素和山奈酚。30 批样品的HPLC 指纹图谱聚类分析及相似度评价可知，S1 至S10 号为第一类，为斑地锦，（其相似度＞0.916），S11 至S18 号为第二类，为匍匐大戟（相似度＞0.884），S19 至 S24 号是第三类，为千根草（相似度＞0.979），S25 至 S30 号为第四类，为台西地锦（相似度＞0.939）；斑地锦与匍匐大戟、台西地锦、千根草的共有模式图谱的相似度分别为0、0.581、0.116，匍匐大戟与台西地锦、千根草的相似度分别为0.056、0.172，台西地锦与匍匐大戟的相似度为0.166，从指纹图谱、相似度、聚类分析、主成分分析都可证明该方法能够较客观地鉴别斑地锦及其近缘种药材。

4 讨论

相似度分析结果表明同种药材样品的质量稳定，差异小，受不同采收季节及产地的影响较小。斑地锦与台西地锦、匍匐大戟、千根草之间的相似度较小，同时，比较它们的共有模式图谱，不同种的色谱图差异较大，表明它们的化学成分存在一定的差异。聚类分析、主成分分析结果一致，同种样品聚为一类，将不同种样品进行有效区分。

斑地锦作为地锦草药材之一，收载于历年版《中国药典》，而千根草、匍匐大戟、台西地锦与斑地锦为近缘种药材，它们的药材性状、显微结构特征等较为相似，在民间常混合使用。但相似度、共有模式图谱、聚类分析、主成分分析结果均表明，斑地锦及其近缘种药材的成分存在较大差异，能否混为使用有待进一步研究。