辽藁本配方颗料标准汤剂UPLC特征图谱研究

王晓彤 张志强 高扬 周永康 田聪慧

【摘 要】 目的：建立辽藁本标准汤剂UPLC特征图谱。方法：采用BEH Shield RP 18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），乙腈-0.1%磷酸溶液进行梯度洗脱，流速为0.4 mL/min，柱温30 ℃，波长280 nm，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2012版）进行特征图谱分析。结果：对15批辽藁本标准汤剂建立特征图谱，标定共有特征峰6个，并指认了绿原酸、阿魏酸两个化合物。结论：该方法简便、准确、特征性强，可对现有的辽藁本标准汤剂质量标准作有力补充。

【关键词】 辽藁本;标准汤剂;特征图谱;基原鉴别

【中图分类号】R284.1   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2022）06-0046-06

Study on UPLC Fingerprint of Standard Decoction For Ligusticum Jeholense Nakai et Kitag，Dlspensing Granules

WANG Xiaotong ZHANG Zhiqiang GAO Yang ZHOU Yongkang TIAN Conghui

Beijing Kangrentang Pharmaceutical Co. LTD Beijing Engineering Technology Research Center for

Chinese Medicinal Composition Granules， Beijing 101301，China

Abstract：Objective  Establish the characteristic chromatogram of Liaogaoben standard decoction by UPLC.Methods BEH shield RP 18 column （2.1×100 mm，1.7 μm） The flow rate was 0.4 mL/min and the column temperature was 30 ℃. The wavelength was 280nm， and the similarity evaluation software （2012 Edition） was used to analyze the characteristic chromatogram.Results the characteristic chromatogram of 15 batches of Liaogaoben standard decoction was established， 6 characteristic peaks were demarcated， and chlorogenic acid and ferulic acid were identified. Conclusion the method is simple， accurate and characteristic， which can be a powerful supplement to the existing quality standard of liaogaoben decoction.

Key words：Ligusticum Jeholense Nakai et Kitag;Standard Decoction; Specific Chromatogram; Primary Identification

辽藁本为伞形科辽藁本Ligusticum jeholense Nakai et Kitag.的干燥根茎和根，秋季茎叶枯萎或次春出苗时采挖，具有祛风、散寒、除湿、止痛的功效;主治风寒感冒、巅顶疼痛、风湿痹痛[1]， 始载于《神农本草经》，列为中品。主要分布于山西、山东、河北、辽宁、吉林[2]等地。

目前针对于辽藁本的研究集中在化学成分、药理作用及科学种植等方面，尚未发现有辽藁本标准汤剂的相关研究。有学者[3]指出辽藁本挥发油的主要成分是水芹烯、醋酸松柏酯、肉豆蔻醚等。藁本、辽藁本所获得的HPLC指纹图谱大致相似，仅少数峰峰面积存在一定差异。在分子鉴定领域，有学者通过不同产地川芎及藁本、辽藁本的ITS2序列的比较发现，藁本、辽藁本GC含量、变异位点及遗传距离均提示二者亲缘关系近，极有可能是同一物种的两个变种或者其中之一为另一个的变种[4]。林伟雄等[5]建立了辽藁本药材的UPLC特征图谱，比较了药材与药渣之间的区别，为药渣的二次利用提供了一定依据。

中药标准汤剂是由单味中药饮片经水提、浓缩、干燥而成，被作为中药配方颗粒的中间体，配方颗粒经中医临床配方后，供患者即冲即服，具有方便携带、便于调配等优点[6]。近年来，随着市场份额的不断扩大，迫切的需要统一质量标准。但由于加工为中间体标准汤剂后，外在的性状、显微特征消失，无法通过传统鉴别方法确定基原，从而影响对其质量的全面控制。本研究采用UPLC法建立了辽藁本特征图谱，不仅可以为辽藁本配方颗粒质量标准提供依据，还可以用于不同基原药材的鉴别，具有快速、准确、专属性强等特点。

1 材料

1.1 仪器 Waters ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜仪，PDA Detector检测器，TUV Detector检测器，Empower 3色谱工作站。ME104E电子天平（梅特勒·托利多），JY20002电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），KQ-500DB超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。微电脑陶瓷煎药壶（永达基电器厂）; DZKW-4电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）;DHG-9245A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）;LGJ-10F冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）;N-1100旋转蒸发仪、CCA-1112冷却水循环装置、MZ2cNT气动薄膜真空泵（日本东京理化器械株式会社）。3797C9C7-97CA-413E-B33A-230C11A465B6

1.2 试药 阿魏酸对照品（批号：110773-201614，纯度99.0%，中国食品药品检定研究院）;藁本对照药材（批号：121128-201202，中国食品药品检定研究院）;辽藁本对照药材（批号：121129-201702，中国食品药品检定研究院），乙腈（Merck），磷酸（Fisher），水（广州屈臣氏），其余试剂均为分析纯。辽藁本药材共15批，经北京康仁堂药业有限公司于立伟经理鉴别为辽藁本Ligusticum jeholense Nakai et Kitag.，研究人员自行加工为饮片，作为标准汤剂原料。药材详细信息见表1。

2 方法与结果

2.1 标准汤剂制备 以卫生部、国家中医药管理局发布的《医疗机构中药煎药室管理规范》[7]和国家药典委员会发布的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求（征求意见稿）》[8]为依据，考察辽藁本标准汤剂工艺条件，以制备 “辽藁本标准汤剂”， “辽藁本标准汤剂”的制法为：取辽藁本饮片，置于砂锅中，浸泡30 min，一煎加入饮片量10倍水，武火煮沸后，文火煎煮30 min，趁热过滤，迅速冷却，备用;二煎加饮片量8倍水，武火煮沸后，文火煎煮20 min，趁热过滤，迅速冷却备用;合并滤液，浓缩（50 ℃），浓缩至料液比约为1∶[KG-*3/5]1（相对密度为1.05～1.10（50 ℃），冷冻干燥，即得。以上述方法制备15批次辽藁本标准汤剂。

2.2 色谱条件 Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP 18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱：0～7.5 min，5～23% A;7.5～12 min，23～100% A，记录12 min色谱图;检测波长280 nm;柱温30 ℃;流速0.4 mL/min;進样量2 μL。

2.3 供试品溶液的制备 取辽藁本标准汤剂粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称重，超声处理20 min，放冷，用70%甲醇补足减失的重量，过滤，取续滤液，0.2 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

2.4 对照药材溶液的制备 取辽藁本对照药材2.5 g，加入18倍水，煮沸50 min，按照标准汤剂制备工艺制备，滤过，滤液减压浓缩至干，置具塞锥形瓶中，加70%甲醇50mL，密塞，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）20 min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材溶液。

2.5 对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1毫升含0.1 mg的溶液，即得。

2.6 方法学考察

2.6.1 重复性实验 取同一批辽藁本标准汤剂（批号：190116-113301-01）6份，按“2.2”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果显示各共有峰相对保留时间无明显变化，RSD值为0.47%～1.00%，相对峰面积RSD值为1.70%～2.78%，表明该方法重复性良好。

2.6.2 中间精密度实验 取同一批辽藁本标准汤剂（批号：190116-113301-01）6份，按“2.2”项下方法制备6份供试品溶液，使用另一台waters UPLC H-Class仪器，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果显示各共有峰相对保留时间无明显变化，RSD值为0.06%～0.17%，相对峰面积RSD值为0.28%～1.35%，不同仪器间相对保留时间RSD值为0.32%～0.73%，相对峰面积RSD值为1.76%～8.02%，表明该方法中间精密度良好。

2.6.3 稳定性 精密吸取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果显示各共有峰相对保留时间无明显变化，RSD值为0.32%～1.25%，相对峰面积RSD值为1.12%～1.99%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 特征图谱的建立与分析

2.7.1 特征峰指认 分别取“2.3”项下供试品溶液与“2.4”项下对照品溶液，按照“2.2”项下色谱条件进样，记录色谱图，如图1所示。将供试品色谱峰与对照品色谱峰的保留时间进行对比，确定供试品溶液中，3号峰为绿原酸，5号峰为阿魏酸。

2.7.2 特征图谱的建立 分别取15批辽藁本标准汤剂供试品，按照“2.2”色谱条件获得其液相图谱，如图2所示，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版本），以S1液相图谱为参照图谱，按中位数计算，得出辽藁本配方颗粒对照图谱，选择6个分离度较好的色谱峰为特征峰，并进行特征峰的标识。

2.7.3 共有峰相对保留时间、相对峰面积的测定 根据对照品的可获得性及各特征峰所推断的物质在药效方面的代表性，确定了阿魏酸为参照物，同时由于其保留时间及峰面积在特征图谱中的情况，确定5号峰（阿魏酸）为参照峰，计算各特征峰与5号峰的相对保留时间和相对峰面积，对15批辽藁本标准汤剂冻干粉特征图谱进行数据处理。其结果见表2和表3。

2.7.4 不同批次标准汤剂特征图谱相似度分析 使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版本），计算15批辽藁本标准汤剂特征图谱与对照特征图谱的相似度，其结果如下。15批辽藁本标准汤剂特征图谱与对照特征图谱的相似度为0.984～1.000，均高于0.98，表明图谱的差异较小。见表4。

2.7.5 对照药材图谱 取辽藁本对照药材溶液，在相同的色谱条件下进行测定，结果如图4所示。由结果可知，样品色谱图与对照药材对应良好。

3 讨论

比较了不同波长（254 nm、280 nm、320 nm），不同柱温（25 ℃、30 ℃、35 ℃），不同流速（0.38 mL/min、0.4 mL/min、0.42 mL/min），不同流动相（乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%甲酸）的分离效果，结果以波长280 nm，柱温30 ℃，流速0.4 mL/min，流动相为乙腈-0.1%磷酸时，分离效果较好。3797C9C7-97CA-413E-B33A-230C11A465B6

比较了不同提取溶剂（乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇），不同提取方式（超声、回流），不同提取时间（20 min、30 min、40 min），最终确定以70%甲醇超声提取20 min效果最好。

本研究获得了15批辽藁本标准汤剂的特征图谱，并进行了相似度计算，相似度结果均大于0.98，结果表明，不同产地的辽藁本药材差异较小，整体一致，有较高的相似性，可以提供全面的质量信息。

辽藁本药材一直以来都以野生、半野生为主，但由于早期中药材的生产处于粗放型状态，过度挖掘，对其生境的严重破坏，使大的自然居群越来越少。笔者通过走访各大型药材市场发现，目前市场上的药材以辽藁本栽培品为主，质量以东北产为佳。辽藁本中的主要成分为苯肽类、挥发油类及酚酸类成分，作为标准汤剂使用时，由于经过高温水煮，挥发油成分损失较大，此时以阿魏酸为主的酚酸类成分则为辽藁本中的主要成分。本法所使用的对照图谱为对照药材模拟标准汤剂制备后得到的特征图谱，与标准汤剂保持高度一致性，对比分析更准确，专属性更强，这对于辽藁本标准汤剂质量的有效控制及合理应用都具有一定的意义。

参考文献

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[7]卫生部. 国家中医药管理局. 医疗机构中药煎药室管理规范[EB/OL].http：//yzs.satcm.gov.cn/gongzuodongtai/2018-03-25/6577.html，2009-03-16.

[8]国家药品监督管理局. 中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求（征求意见稿）[EB/OL].https：//www.nmpa.gov.cn/directory/web/nmpa/xxgk/zhqyj/zhqyjyp/20191108160401438.html，2019.

（收稿日期：2021-07-14 编辑：陶希睿）3797C9C7-97CA-413E-B33A-230C11A465B6