龙眼干制前后缓解小鼠疲劳作用的研究

高慧颖，姜 帆

（1福建省农业科学院农业工程技术研究所，福州 350003；2福建省农业科学院果树研究所，福州 350013）

0 引言

龙眼(Dimocarpus longan Lour.)又名桂圆，是中国南方的特色药食同源果品，素有“南人参”的美称，早在《神农本草经》中记载久服桂圆可以轻身不老通神明，是深受消费者喜爱的滋补佳品[1-2]。龙眼果肉含有丰富的化学成分，其中生物活性成分多样，如多糖、黄酮、多酚等[3]。其药理活性研究显示，龙眼具有抗氧化、调节内分泌、增强免疫力、缓解焦虑等功能[4-5]。疲劳作为机体内在保护机制，是一种复杂代谢活动。长期疲劳会让人精神不振，内分泌紊乱、免疫力低，身体处于亚健康状态，严重时可引发器质性疾病。缓解疲劳的活性成分是近年国内外学者的研究热点。已证实的具有缓解运动疲劳的活性成分有生物活性肽类和氨基酸、多糖、多酚、生物碱等，它们都具有较强的抗氧化能力[6-7]。研究推测运动疲劳时人体内的氧化还原平衡被破坏，产生的自由基和活性氧不能及时清除，从而感到疲劳，通过补充外源性的抗氧化剂达到缓解疲劳的效果[8]。谭飔等[9]研究表明蜀冠龙眼热风干制后果肉多酚含量明显降低，抗氧化活性显著下降。王诗琪等[10]分析了新鲜和热风干制后储良龙眼多糖的抗氧化和免疫活性，结果显示干制后多糖的清除自由基能力明显减弱，但免疫活性增强。聂英涛等[11-12]发现新鲜龙眼多糖在体外试验中可增强抗氧化能力，动物试验中明显延长小鼠负重游泳时间，小鼠尿素氮、乳酸、丙二醛含量降低，明显缓解小鼠运动疲劳。同时，周嘉华等[13]证实龙眼干多糖、郭超萍等[14]证实龙眼干果肉水提取物均具有明显的抗疲劳作用。宫亚东等[15]制备的枸杞龙眼复合运动饮料也可显著延长小鼠负重游泳时间。前期研究证实新鲜龙眼和干制龙眼中均含有丰富的缓解疲劳的活性成分，且具有缓解运动疲劳的效果。但未见对同一龙眼品种干制前后缓解疲劳差异的对比报道。本试验拟通过给小鼠喂食同一品种的新鲜龙眼和龙眼干粉，对比小鼠负重游泳力竭时间和血清生化指标的差异，评价龙眼干制前后缓解疲劳的效果，为今后提高龙眼生物活性的加工利用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 样品制备

2020年9月福建省莆田市华亭镇宫利村国领农场采集新鲜龙眼样品，品种为传统焙干良种‘乌龙岭’，挑选成熟、无病虫害、正常发育的果实用于样品制备。

鲜龙眼冻干粉的制备：新鲜龙眼快速转移到实验室去皮去核，-40℃预冻24 h，冷阱温度-45℃、真空度10 Pa升华24 h，温度55℃真空度10 Pa解析干燥5 h[16]。冻干果肉立即破壁粉碎后备用。

龙眼干冻干粉的制备：新鲜龙眼放入80℃热风干燥箱中烘干至恒重，去皮去核得到果肉，真空冷冻干燥方法同鲜龙眼冻干粉。

冻干粉按照1:10加蒸馏水充分混合后，7000 rpm离心10 min，取上清液45℃真空浓缩至3.3 mL/g保存待用。

1.2 试验动物

SPF级雄性ICR小鼠，20～22 g，许可证号码SCXK（沪）：2017-0005，合格证号：0036802，购自上海斯莱克试验动物有限责任公司。

动物饲养条件：温度(26±1)℃，湿度50%～60%，12 h交替照明/黑暗，自由摄食、饮水。试验地点为福建省中医药研究院动物实验室，于2020年11月完成。

1.3 试剂和仪器

洋参含片，广东康富来药业有限公司，批号：KJ003；ELISA试剂盒，上海酶联生物科技有限公司，批号：LOT20201211A。

FD-1D-50型冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；HS0950全自动料理机，西屋厨房小家电有限公司；BSA电子分析天平，德国赛多利斯集团；UPW-20N型超纯水机，北京历元电子仪器有限公司；GL-21M高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；RE-5203旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；HWS-24电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；CLARIO star多功能酶标仪，德国BMG Labtech公司；BS400全自动生化仪，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 动物分组及给药 ICR雄性小鼠试验前适应性喂养3天后，按照体重随机分成4组，每组10只，分别为空白对照组（蒸馏水）、阳性对照组（洋参含片，0.2 g/kg）、鲜龙眼组(6 g/kg)、龙眼干组(6 g/kg)。试验过程中，按0.2 mL/10 g的体积灌胃，每天1次，连续给药21天。

1.4.2 小鼠各生化指标的测定

体重测定[17]：分别在第1、7、14、21天给药1 h后称量小鼠的质量，计算净体重增率，数据保留至0.1 g。

负重游泳试验[17]：于末次给药1 h后，将为小鼠质量4%的铅块系于尾部，放入水深40 cm，水温(25±1)℃的游泳池中负重游泳。记录自开始至头部沉入水中，10 s仍不能返回水面的时间，即小鼠的力竭游泳时间。

血尿素氮和血乳酸脱氢酶含量测定[17]：负重游泳休息60 min后立即眼眶采血，4℃3500 rpm离心10 min，收集血清，按照试剂盒要求检测血尿素氮和血乳酸脱氢酶含量。

肝糖原含量测定[17]：眼眶采血完毕处死小鼠，取肝脏组织匀浆，按照试剂盒的要求检测肝糖原含量。

1.5 数据分析

数据分析选用SPSS 22.0统计软件完成，独立样本的t检验差异显著性，结果用x±SD表示。

2 结果与分析

2.1 龙眼干和鲜龙眼对试验小鼠体重的影响

灌胃给药后各组试验小鼠体重增加呈相同的趋势（表1）。给药21天后龙眼干组的试验小鼠体重从(22.7±0.9)g增加到(33.4±1.6)g，提高了47.1%，高于鲜龙眼组(44.9%)和阳性对照组(46.5%)。但与空白对照组相比，3个试验处理组的小鼠体重均差异不显著(P＞0.05)，说明龙眼干制前后对试验小鼠体重增加无明显的影响。

表1 龙眼对试验小鼠体重的影响

2.2 龙眼干和鲜龙眼对试验小鼠力竭游泳时间的影响

游泳时间延长是运动耐力加强的直接、客观指标，可以直观反映受试药品的抗疲劳试验效果[17]。试验小鼠灌胃给药龙眼后力竭游泳时间出现不同程度延长（图1）。龙眼干组小鼠的力竭游泳时间为(1322.5±309.3)s，比空白对照组相比延长59.3%，达到极显著水平(P＜0.01)，接近阳性对照组；而鲜龙眼组小鼠的力竭游泳时间比空白对照组相比延长40.7%(P＜0.05)。表明龙眼可以显著延长试验小鼠的力竭游泳时间，其中龙眼干效果更好，表现出更好的缓解疲劳潜力。

图1 龙眼对试验小鼠力竭游泳时间的影响

2.3 试验小鼠游泳后肝糖原含量的变化

糖原是运动能量的重要来源，其含量直接影响机体运动能力，被作为评价疲劳发生快慢或程度的生化指标[18]。龙眼干和鲜龙眼均可以提高受试小鼠游泳后血清中肝糖原的含量（图2）。分析表明，龙眼干组比空白对照组小鼠血清中肝糖原含量提高34.7%，方差分析达到极显著水平(P＜0.01)，明显高于鲜龙眼组(18.7%)。说明龙眼干比鲜龙眼能提供更多的肝糖原，以维持机体正常的运动功能。

图2 试验小鼠游泳后肝糖原含量的变化

2.4 试验小鼠游泳后血尿素氮含量的影响

血尿素氮是运动后的代谢产物，可以反映机体内蛋白质的分解、合成代谢状况和肌肉细胞大强度运动后的损伤及恢复情况，被用来评价机体在运动情况下体力负荷的承受能力[18]。试验结果显示龙眼干和鲜龙眼均可以有效地降低小鼠血尿素氮的含量（图3）。龙眼干组试验小鼠的血尿素氮含量比空白对照组降低13.8%，高于鲜龙眼组(12.1%)，方差分析均达到显著差异水平(P＜0.05)，与阳性对照组一致。

图3 试验小鼠游泳后血尿素含量的变化

2.5 试验小鼠游泳后血乳酸脱氢酶(LDH)含量的影响

乳酸脱氢酶的功能是减少运动后乳酸在肌肉中的堆积。研究表明，阳性对照组、龙眼干组和鲜龙眼组给药后均可以提高小鼠血清中LDH的含量（图4）。分析表明，龙眼干组中LDH含量比空白对照组提高35.8%(P＜0.05)，而鲜龙眼组则提高35.9%(P＜0.01)。说明龙眼能显著增加小鼠LDH总活力，有效地清除游泳后机体的代谢产物，延缓疲劳的发生，鲜龙眼组的效果更佳。

图4 试验小鼠游泳后LDH含量的变化

3 讨论

3.1 龙眼的缓解疲劳功效

疲劳是机体不能持续其机能在一定水平上或不能维持预定运动强度的一种状态，主要表现为倦怠、乏力、烦躁，工作效率下降，身体与精神状态不佳，若长期积累不及时消除，可逐渐发展成为慢性疲劳综合征，危害身心健康[19]。随着全球化经济发展，快节奏的生活方式引发亚健康群体逐渐增大。据不完全统计，中国处于亚健康的人群超过半数，而且群体数量还在增加。亚健康人群的最典型特征就是容易产生疲劳感、免疫力低下等[20-21]。龙眼是中医中常用于养心安神、强魄健体的一味主药，近年在治未病方面应用较多[22]。本试验结果表明灌胃干制龙眼果肉小鼠的力竭游泳时间最长，与阳性对照洋参含片无差异，这一结论为中医中用龙眼作为主药治疗亚健康疾病提供理论依据。

3.2 龙眼干制前后缓解疲劳的差异

研究发现灌胃新鲜龙眼小鼠的力竭游泳时间、血乳酸脱氢酶含量显著高于对照组，血尿素氮含量显著低于对照组，这与聂英涛等[11]试验中新鲜龙眼多糖在低中高剂量组抗疲劳作用的研究结果一致，也与以龙眼汁为主要成分运动功能饮料延长小鼠负重游泳时间的结论[15]一致。推测多糖是新鲜龙眼缓解运动疲劳的主要活性成分之一，也可能和龙眼中丰富的哌啶、氨基酸、黄酮等代谢组分[23]有关。

课题组前期研究显示龙眼果肉中的可溶性糖为葡萄糖、果糖、蔗糖，干制后糖组分不变，果糖、葡萄糖的占比提高，蔗糖占比降低[24]。本研究显示小鼠灌胃龙眼干后，其肝糖原含量极显著高于新鲜龙眼组，与阳性对照组无差异，推测可能与干制后龙眼果实中糖原合成底物之一的葡萄糖等含量增加有关。因为长时间紧张运动导致体力的衰竭总是和肌糖原的耗竭同时发生[25]，龙眼干可能增加肝糖原储备或/和减少运动时肝糖原的消耗来提供更多能量，从而抵抗疲劳的产生。

本研究中龙眼干组的试验剂量为6 g/kg，该剂量条件下可以极显著促进肝糖原积累，延长负重游泳时间，与郭超萍等[14]高剂量组(9 g/kg)的结论一致。而在降低血尿素氮含量，提高乳酸脱氢酶含量的指标上，与郭超萍等[14]中剂量组(4.5 g/kg)的结论一致，比高剂量组的效果差。体外试验结果显示龙眼干制后多糖、多酚的DPPH、ABTS、FRAP和清除羟自由基能力均有减弱的结论[9-10]不一致。但与韩苗苗等[26]的研究结果龙眼干燥处理后多糖的DPPH、羟自由基清除能力、FRAP能力增强的结论一致。推测干燥过程中高温促进美拉德反应的发生，果肉中的蛋白质和多糖或美拉德产物进一步聚合，生成噻吩、噻唑、吡咯等杂环化合物增强清除自由基的效果，还可能生成吡咯酮、还原酮类、脱氧果糖嗪等来提高总抗氧化能力[27-28]。龙眼中已经鉴定出9大类23个亚类共706种成分[23,29]，今后将对龙眼干制前后代谢成分进行分析和功能鉴定，也将探讨干制过程中美拉德反应产物的变化，以期明确龙眼的缓解疲劳机制并筛选出对应的功能因子。

4 结论

本研究通过小鼠的负重游泳试验说明龙眼果肉干制前后均对小鼠的体重无影响，均具有明显的缓解运动疲劳效果。龙眼干制后缓解运动疲劳的效果显著优于新鲜龙眼，两者缓解疲劳的机制存在差异。新鲜龙眼主要通过显著降低血尿素氮的含量和血乳酸脱氢酶的积累来延长小鼠的力竭游泳时间达到缓解运动疲劳。龙眼干则主要通过显著提高小鼠血清中的肝糖原含量，降低血尿素氮含量来延长力竭游泳时间达到缓解运动疲劳。该试验结果也佐证了传统药典以龙眼干果肉入药的合理性。