不同产地、不同年限铁皮石斛多糖中单糖组成的HPLC分析

于小芳

(郑州市中医院 制剂室，河南 郑州 450000)

铁皮石斛为兰科石斛属植物，最早见于东汉的《神农本草经》，是我国最早记载被用作治病的兰科植物之一。铁皮石斛药用历史悠久，至今已经历了两千多年的用药验证，中医认为铁皮石斛性微寒﹑味甘，归胃﹑肾经，具有益胃生津，滋阴清热的功效；现代药理学证实其具有促进胃肠蠕动﹑增强免疫功能﹑抗肿瘤﹑抗衰老﹑降血糖﹑抗诱变﹑抑菌等作用。铁皮石斛属于兰科植物，喜欢在凉爽﹑潮湿的环境中生长，且其不耐寒，对温度的要求很高，适宜生长温度在15～28℃左右；我国多分布在安徽﹑浙江﹑云南﹑广东等地区。现代研究发现，铁皮石斛的化学成分主要是石斛多糖，具有较高的药用价值。已有研究显示，不同产地﹑不同年限的铁皮石斛多糖组成有所差异，其药效作用也有所差异。高效液相色谱(HPLC)是目前药物成分分析﹑药物质量控制的重要手段。既往研究采用HPLC分析了不同产地铁皮石斛的质量，但对不同产地和年限的相关研究鲜有报道。因此，本研究分析了云南不同产地﹑不同年限铁皮石斛的HPLC分析，旨在为铁皮石斛的临床应用提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 试剂

D-盐酸氨基葡萄糖对照品，D-甘露糖对照品，D-葡萄糖对照品，均由中国药品生物制品检定所提供；乙酸铵﹑苯酚﹑1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-pheny-3-methyl-5-pyrazolone，PMP)﹑三氟乙酸溶液﹑氢氧化钠﹑盐酸溶液﹑乙腈(色谱纯)﹑甲醇﹑无水乙醇﹑三氯甲烷。

1.1.2 仪器设备

SHIMADZU分析天平，感量0.1 mg；电子天平，感量0.1g；纯化水系统；微量移液器；Agilent 1200高效液相色谱仪；色谱柱，Agilent C18；超声仪等。

1.1.3 试验药物

云南文山种(1～3年生)﹑云南西双版纳种(1～3年生)﹑云南保山种(1～3年生)铁皮石斛分别购自云南文山﹑西双版纳﹑保山地区药材公司。

1.1.4 药物及试剂的制备

对照品溶液的制备：使用电子天平精密称取60 mg D-盐酸氨基葡萄糖对照品粉末，加适量纯净水溶解后，倒入5 mL容量瓶中，然后加入纯净水稀释至刻度，制成12 mg/mL的内标溶液；另同样方法称取10 mg甘露糖和10 mg葡萄糖对照品，加适量纯净水溶解后，倒入100 mL容量瓶中，并加入1 mL内标溶液(在1 mL量筒中加入内标溶液至刻度)，然后加入纯净水稀释至容量瓶刻度线，摇匀后备用。

铁皮石斛多糖的提取：干燥铁皮石斛药材分别研磨粉碎，过三号筛(50目)后，使用电子天平精密称取0.12 g粉末倒入100 mL干燥洁净圆底烧瓶中，加入适量80%乙醇溶液，加热回流提取4 h，弃去滤液，滤渣烘干乙醇后置入100 mL烧杯中，重复提取两次，合并滤渣，并加入2 mL内标溶液(在2 mL量筒中加入内标溶液至刻度)，加水100 mL搅拌均匀，电热套或沸水浴煮1 h，过程中不停地进行搅拌，放冷，加水至100 mL，混匀，离心，备用。

铁皮石斛多糖的水解：吸取1 mL铁皮石斛多糖溶液， 置入安瓿瓶中，加入2.0 mol/L的三氟乙酸溶液2 mL，酒精喷灯封口后，120℃烘箱中水解4 h，除去不溶物(滤膜过滤)和三氟乙酸(减压旋转蒸发)，纯净水洗涤，重复过滤﹑蒸发3次后，加入2 mL蒸馏水溶解后，倒入玻璃试管(带磨口塞)中，减压干燥箱干燥过夜(温度设定为70℃)，保存，备用。

衍生化产物的制备：吸取400 μL甘露糖和葡萄糖对照品溶液以及供试品溶液于试管中，加0.5 mol/L的 PMP甲醇溶液与0.3 mol/L的氢氧化钠溶液各400 μL，混匀，70℃水浴反应100 min。再加0.3 mol/L的盐酸溶液500 μL，混匀，用三氯甲烷洗涤3次，每次 2 mL， 除去三氯甲烷液，水层离心后，取上清液，保存。

流动相的配制：以乙腈-0.02mol/L的乙酸铵溶液(20∶80)为流动相。

1.2 实验方法

1.2.1 HPLC

样品的制备：取铁皮石斛多糖衍生化产物的制备液逐步稀释为0.5μg/mL ，稀释液为初始流动相，空白对照为初始流动相。取10μL样品上样检测。

1.2.2 定量计算方法

以D-盐酸氨基葡萄糖为内标，利用校正因子来计算。

注：As为内标峰面积，Ar为甘露糖标准品峰面积，Cs为内标浓度，Cr为甘露糖标准品浓度。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 铁皮石斛多糖HPLC分析方法的建立

铁皮石斛HPLC色谱条件的设置：色谱柱:Agilent C色谱柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；检测波长：250 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；进样体积：10 μL，流动相比例为20∶80。HPLC分析方法检测显示，铁皮石斛葡萄糖﹑甘露糖的出峰时间分别为26.89 min﹑58.0 3min，出峰附近没有杂峰干扰，峰型尖锐，分离度好，可以满足分析要求，见图1。

图1 对照品的HPLC检测色谱图

2.2 不同产地、不同年限铁皮石斛多糖中单糖的HPLC检测色谱图

将不同产地﹑不同年限的9批铁皮石斛多糖样品依次进行HPLC检测，记录75 min色谱图。见图2。

图2 样品HPLC检测色谱图

2.3 不同产地、不同年限铁皮石斛多糖中单糖的HPLC检测色谱图分析

云南文山﹑西双版纳﹑保山三个产地的铁皮石斛多糖中甘露糖含量有一定差异，其中云南文山种铁皮石斛多糖中甘露糖含量最高，甘露糖/葡萄糖的比值也高于西双版纳﹑保山产地，而西双版纳种铁皮石斛多糖中甘露糖含量﹑甘露糖/葡萄糖的比值高于保山，以上差异均有统计学意义(＜0.05)；1年生﹑2年生﹑3年生的铁皮石斛多糖中甘露糖含量同样有一定差异，年限越高的铁皮石斛中甘露糖的含量越高，甘露糖/葡萄糖的比值也越高，以上差异均有统计学意义(＜0.05)。见表1。

表1 不同产地、不同年限铁皮石斛多糖中样品甘露糖含量和甘露糖与葡萄糖峰面积测定结果

3 讨 论

HPLC是色谱法的一种，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂﹑缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。通过分析比较各样品的HPLC色谱图，可反映样品中的化学成分，临床常用于食品﹑药品的成分分析和质量评价。铁皮石斛是一种常见的中药材，铁皮石斛多糖是其主要化学成分，具有抗氧化﹑抑菌﹑调节免疫等多种药理作用。铁皮石斛分布于我国多种产地，且不同年限的中药材可能有不同的药用价值，但目前对于不同产地和年限铁皮石斛的系统分析少有报道。因此，本研究建立了不同产地和年限铁皮石斛的HPLC图谱，以期为临床药用研究提供数据支持。本研究中采用HPLC法建立了云南不同产地和年限铁皮石斛多糖的色谱图，以铁皮石斛多糖的主要单糖组成铁皮石斛甘露糖为对照品。本研究参照《中国药典》中铁皮石斛多糖中甘露糖的检测方法，加入PMP进行铁皮石斛多糖中的单糖衍生处理，HPLC色谱条件为严格参照药典进行，流动相为乙腈-0.02mol/L的乙酸铵溶液，检测波长为250 nm。结果显示，铁皮石斛葡萄糖﹑甘露糖的出峰时间分别为26.89 min﹑58.03 min，出峰附近没有杂峰干扰，峰型尖锐，分离度好，可以满足分析要求。

本研究将云南文山﹑西双版纳﹑保山三个产地﹑1年生﹑2年生﹑3年生三个年限铁皮石斛多糖样品依次进行HPLC检测，记录75 min色谱图。云南文山﹑西双版纳﹑保山三个产地的铁皮石斛多糖中甘露糖含量有一定差异，其中云南文山种铁皮石斛多糖中甘露糖含量最高，甘露糖/葡萄糖的比值也高于西双版纳﹑保山产地，而西双版纳种铁皮石斛多糖中甘露糖含量﹑甘露糖/葡萄糖的比值高于保山；1年生﹑2年生﹑3年生的铁皮石斛多糖中甘露糖含量同样有一定差异，年限越高的铁皮石斛中甘露糖的含量越高，甘露糖/葡萄糖的比值也越高。年限较高的铁皮石斛具有的药物活性成分越高，有很高的经济和药用价值。近年来，铁皮石斛种植在我国南方地区迅速发展，并成为南方特色生物产业；云南铁皮石斛是我国最珍贵的中药材之一，云南野生铁皮石斛已被列为濒危植物，2008年云南石斛的种植面积已成为全国第一大省。已有研究显示，云南种铁皮石斛中多糖含量丰富，铁皮石斛多糖是目前常用于评估铁皮石斛质量的有效成分。而在本研究中发现，铁皮石斛多糖中单糖组成主要为甘露糖和葡萄糖，与高云霄等的研究基本一致，葡萄糖具有保护肝脏﹑补充热能和体液﹑改善低血糖﹑改善脱水等作用；甘露糖具有调节免疫系统﹑增加伤口愈合﹑抑制炎症﹑抑制肿瘤生长与转移﹑抑制细菌感染等作用，提示铁皮石斛多糖中单糖组成比例可能会影响药物活性，后期需进一步采用动物试验或体外细胞试验进行深入分析。本研究中云南文山种高年限铁皮石斛中铁皮石斛甘露糖含量较高，可用于临床药用。

综上所述，不同产地﹑不同年限铁皮石斛中铁皮石斛多糖中的单糖组成有所差异，临床可根据铁皮石斛的HPLC色谱图进行鉴别和质量评估。