Ghsr－/－小鼠黑质ATP敏感性钾通道亚基表达改变

吕吉荣　肖雪　焦倩　陈曦　杜希恂　姜宏

[摘要]目的 探讨生长激素促分泌素受体1a（GHSR1a）基因敲除小鼠黑质ATP敏感性钾通道（K_ATP通道）亚基的表达变化。方法 选取5只3月龄GHSR1a敲除（Ghsr^-/-）小鼠和5只同窝野生型（WT）小鼠，应用蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR方法检测小鼠黑质K_ATP通道组成亚基SUR1、SUR2B、Kir6.2的蛋白和mRNA水平。结果 与WT组相比，Ghsr^-/-组小鼠黑质K_ATP通道组成亚基SUR1蛋白表达水平降低（t=3.389，P<0.05），而SUR2B、Kir6.2蛋白表达无明显变化（P>0.05）。两组小鼠黑质KATP通道组成亚基SUR1、SUR2B、Kir6.2的mRNA表达水平差异均无显著性（P>0.05）。结论 GHSR1a基因敲除会导致黑质K_ATP通道组成亚基SUR1蛋白的表达降低。

[关键词]受体，胃促生长素;黑质;K_ATP通道;小鼠，基因敲除

[中图分类号]R338.2 [文献标志码]A [文章编号]2096-5532（2022）03-0329-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.088

CHANGE IN THE EXPRESSION OF ATP-SENSITIVE POTASSIUM CHANNEL SUBUNITS IN THE SUBSTANTIA NIGRA OF GHSR^-/-MICE

L? Jirong， XIAO Xue， JIAO Qian， CHEN Xi， DU Xixun， JIANG Hong

（State Key Disciplines： Physiology （in Incubation）， Department of Physiology， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT] ObjectiveTo investigate the change in the expression of ATP-sensitive potassium channel （K_ATPchannel） subunits in the substantia nigra of mice with growth hormone secretagogue receptor 1a （GHSR1a） gene knockout. MethodsFive GHSR1a-knockout （Ghsr^-/-） mice and five wild-type （WT） littermates were selected， and Western blotting and quantitative real-time PCR were used to measure the protein and mRNA expression levels of the SUR1， SUR2B， and Kir6.2 subunits of K_ATPchannel in the substantia nigra. Results Compared with the WT group， the Ghsr^-/-group had a significant reduction in the protein expression level of the SUR1 subunit of K_ATPchannel in the substantia nigra （t=3.389，P<0.05）， while there were no significant changes in the protein expression levels of SUR2B and Kir6.2 subunits （P>0.05）.  There were no significant differences between the two groups in the mRNA expression levels of SUR1， SUR2B， and Kir6.2 of K_ATPchannel （P>0.05）. Conclusion

GHSR1a gene knockout can reduce the protein expression of the SUR1 subunit of K_ATPchannel in the substantia nigra.

[KEY WORDS]receptors， ghrelin; substantia nigra; K_ATPchannels; mice， knockout

生長激素促分泌素受体1a（GHSR1a）是一种广泛分布在下丘脑、垂体、腹侧被盖区、中缝核、海马和黑质致密部等区域的G蛋白偶联受体[1]。ghrelin是其唯一的内源性配体[2]。本实验室前期研究结果证实，ghrelin-GHSR1a可以通过改善线粒体功能，拮抗鱼藤酮和1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶诱导的多巴胺（DA）能神经元细胞的死亡[3-4]。同时，GHSR1a还具有本构型活性，即在缺乏配体或激动剂的情况下，受体仍能自发地维持激活并维持下游信号转导通路的活性[5-6]。已有研究结果表明，在小鼠脑内黑质立体定位注射GHSR1a拮抗剂可诱导DA能神经元中GHSR1a表达下调，并导致小鼠运动功能障碍[7]。

ATP敏感性钾通道（K_ATP通道）作为一种内向整流钾通道，由4个内向整流钾通道Kir6.X亚基（Kir6.1或Kir6.2）和4个磺酰脲受体（SUR）亚基组成，具有改善细胞内能量代谢水平和稳定内环境的作用[8-10]。近年来的研究表明，K_ATP通道的选择性激活可能参与了帕金森病（PD）中黑质DA能神经元的损伤[11-12]。PD病人尸检结果显示，脑内黑质残存的DA能神经元上虽然同时表达有SUR1、SUR2B和Kir6.2等3种不同类型的K_ATP通道，但只有SUR1 mRNA水平显著升高，其余亚基表达均无改变[12]。本实验室前期研究结果证实，在3、6和9月龄的PD转基因小鼠黑质中K_ATP通道SUR1亚基的蛋白和mRNA表达水平均显著上调。亦有研究证实，ghrelin-GHSR1a可以通过激活K_ATP通道调节迷走神经节状神经核的兴奋性。而GHSR1a是否也参与调节疾病进展过程中K_ATP通道各亚单位的表达变化尚不清楚。因此，本研究选取3月龄GHSR1a敲除（Ghsr^-/-）小鼠和同窝野生型（WT）小鼠，应用蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR方法对黑质的K_ATP通道各亚基蛋白及mRNA水平进行检测，为阐明GHSR1a与K_ATP通道在PD发病中的相互作用提供实验依据。

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物所用Ghsr^-/-小鼠均购自上海南方模式生物科技发展有限公司。Ghsr^+/-小鼠与Ghsr^+/-小鼠杂交得到下一代小鼠，通过基因鉴定得到Ghsr^-/-小鼠及相应的同窝WT小鼠。本实验选用3月龄的Ghsr^-/-雄性小鼠和同窝WT雄性小鼠作为研究对象，每组5只。小鼠在室温（23±1）℃、12 h昼夜循环光照的环境下进行饲养，可自由饮水与进食。所有动物实验操作均遵循医学伦理学原则。

1.1.2实验仪器及试剂SUR1抗体、SUR2B抗体、Kir6.2抗体均购自美国Abcam公司;β-actin抗体购自中国Bioss公司;山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗均购自美国Santa Cruz公司;SDS-PAGE分离胶缓冲液和SDS-PAGE浓缩胶缓冲液均购自美国Sigma公司;ECL发光液、PVDF膜购自美国Millpore公司;RIPA裂解液、过硫酸铵（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）、BCA试剂盒、Loading buffer均购自中国碧云天公司;TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司;逆转录试剂盒购自美国Thermo公司;SYBR Premix Ex Taq（2×）购自日本Takara公司。所用实验仪器包括电泳仪、电转仪、天能GIS凝胶图像处理系统、高速低温离心机、实时荧光定量PCR仪、分光光度计。

1.1.3实验液体配制0.01 mol/L PBS：称取4.0 g Na₂HPO₄·12H₂O、0.4 g NaH₂PO₄·2H₂O以及9.0 g NaCl，用雙蒸水定容至1 L。电泳缓冲液：称取Tris 1.51 g、甘氨酸7.20 g、SDS 0.50 g，使用双蒸水定容至1 L，调节pH值至8.3。转膜缓冲液：称取Tris 3.0 g、甘氨酸14.4 g，分别加入800 mL的双蒸水和200 mL的甲醇，调节pH值至8.3。TBST溶液：称取Tris 2.42 g、NaCl 8.00 g，用双蒸水定容至1 L，加入1 mL Tween-20，调节pH至7.5。封闭液：用TBST溶液配制的50 g/L脱脂奶粉。

1.2蛋白免疫印迹法检测黑质SUR1、SUR2B和Kir6.2蛋白的表达

小鼠用异氟烷深度麻醉后，断头取脑。根据脑图谱，分别取出大脑双侧黑质区域，并置于预冷的1.5 mL EP管中，分别向EP管内加入100 μL的RIPA裂解液。在冰上用电动研磨棒充分研磨至管内脑组织完全溶解，再置于冰上裂解30 min。把裂解好的组织放入离心机中，在4 ℃下以12 000 r/min的速度离心20 min。离心后取出EP管，将上清液转移到新的EP管中，应用BCA法测定波长562 nm处的吸光度，绘制标准曲线，并计算出待测样本的浓度。配制100 g/L分离胶和50 g/L浓缩胶，按照样品上样量准确上样，蛋白经SDS-PAGE电泳后，湿转到PVDF膜上，转膜完成后，将PVDF膜置于50 g/L脱脂奶粉封闭液中，室温摇床孵育2 h;分别加入一抗SUR1（1∶1 000）、SUR2B（1∶1 000）、Kir6.2（1∶1 000）以及β-actin（1∶1 000），于4 ℃摇床上低速摇动孵育过夜;用1×TBST溶液漂洗3次，每次10 min;加入用1×TBST溶液配制的山羊抗兔二抗（1∶10 000）、山羊抗鼠二抗（1∶10 000），室温摇床孵育1.5 h;再用1×TBST溶液漂洗3次，每次10 min。将PVDF膜置于ECL显影液中孵育1 min，再将PVDF膜置于显影仪中显影并拍摄。用Image J 10.0分析软件对条带进行灰度值分析，以SUR1、SUR2B、Kir6.2与β-actin的比值作为目的蛋白的相对表达水平。

1.3实时荧光定量PCR方法检测黑质中SUR1、SUR2B和Kir6.2的mRNA表达

用TRIzol提取小鼠黑质RNA，按照Thermo公司逆转录试剂盒操作说明，配制两步反应体系，先42 ℃变性60 min、25 ℃反转录5 min，然后升温至70 ℃、作用5 min使反转录酶失活，于4 ℃冷却，将mRNA反转录合成cDNA。采用SYBR Green染料法定量检测目的基因SUR1、SUR2B、Kir6.2及内参照基因GAPDH的表达，按照荧光定量PCR说明书配制PCR反应体系，采用两步法经过40个循环完成扩增，采用2^-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。PCR扩增引物及其序列见表1。

1.4統计学分析

应用Graph Pad Prism 8.0软件进行统计学处理。实验结果以x±s形式表示，两组间比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1Ghsr^-/-小鼠黑质SUR1、SUR2B、Kir6.2的蛋白表达变化

Ghsr^-/-组和WT组3月龄小鼠黑质K_ATP通道亚基SUR1蛋白表达水平分别为0.996±0.120和0.473±0.076（n=5），差异有统计学意义（t=3.389，P<0.05）;SUR2B蛋白表达水平分别为0.899±0.142和0.798±0.118（n=5），差异无统计学意义（t=0.492，P>0.05）;Kir6.2蛋白表达水平分别为0.827±0.081和0.728±0.065（n=5），差异亦无统计学意义（t=0.860，P>0.05）。

2.2Ghsr^-/-小鼠黑质SUR1、SUR2B、Kir6.2的mRNA表达变化

Ghsr^-/-组和WT组3月龄小鼠黑质K_ATP通道亚基SUR1 mRNA的表达水平分别为1.024±0.074和0.990±0.047（n=5），SUR2B mRNA的表达水平分别为1.012±0.082和1.212±0.421（n=5），而Kir6.2 mRNA的表达水平分别为1.137±0.466和1.209±0.118（n=5），两组比较差异均无统计学意义（t=0.294～1.546，P>0.05）。

3讨论

GHSR1a和K_ATP通道都广泛分布于中枢神经系统[13-14]。GHSR1a主要通过与ghrelin结合发挥作用，但是其在缺乏配体激活时也能够对学习记忆、生长发育等发挥调节作用，这就是GHSR1a的本构型活性[15]。先前有研究结果表明，GHSR1a和多巴胺受体1型（DRD1）结合可以在中脑和海马的神经元亚群中共表达，且可在体外形成异源二聚体，从而进一步修饰G蛋白，扩增DA信号[16-18]。然而，在PD特异性诱导的多能干细胞来源的DA能神经元中GHSR1a的表达显著降低，提示GHSR1a与PD密切相关[19]。本实验选取Ghsr^-/-小鼠作为实验对象，通过蛋白免疫印迹法检测到脑内黑质DA能神经元K_ATP通道SUR1亚基蛋白表达水平显著下调，而SUR2B、Kir6.2亚基蛋白表达均未发生明显改变。本研究同时应用实时荧光定量PCR方法检测了K_ATP通道各亚基mRNA表达水平变化，结果显示，Ghsr^-/-小鼠黑质SUR1、SUR2B及Kir6.2的mRNA表达水平均未发生改变。我们推测这可能与GHSR1a基因敲除后DA能神经元内蛋白质降解异常有关，GHSR1a基因敲除一方面可能引起神经元内自噬的过度激活，另一方面可能引起蛋白泛素化水平异常，使蛋白降解增加。但具体机制还有待于进一步探讨。

SUR1是构成K_ATP通道的亚基之一，属于三磷酸腺苷结合盒转运体（ABC）蛋白家族，它主要调节K_ATP通道对ATP、腺苷和药物的敏感性[20-22]。本实验室前期研究证实，携带人A53T突变型α-syn的转基因PD模型小鼠黑质K_ATP通道的SUR1蛋白表达水平显著上调，而Kir6.2和SUR2B的表达无明显变化。另有研究结果显示，PD病人DA能神经元中SUR1的表达水平比正常人高2倍[23]。K_ATP通道SUR1亚单位的表达上调能够激活腺苷酸激活蛋白激酶，促进K_ATP通道的跨膜转运，进而促进其开放[24-25]。但是在PD发病过程中，SUR1的表达异常对于黑质DA能神经元具有何种作用尚不明确。到目前为止，K_ATP通道在PD中的作用还存在一定的争议。在PD发病早期，K_ATP通道的激活可以促进DA释放，从而保护神经元。然而，随着疾病的进一步发展，K_ATP通道会持续激活，造成DA能神经元损伤[26-27]。因此，由GHSR1a基因敲除介导的K_ATP通道SUR1亚单位表达变化的机制及其在PD中的作用还有待于进一步探讨。本文研究结果为GHSR1a与K_ATP通道在PD中的作用研究提供了理论依据。

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（本文編辑马伟平）