卵泡液中GDF-9、SCF、ACTC及FS与PCOS患者卵泡发育的关系

刘建梅

多囊卵巢综合征（Polycystic Ovary Syndrome，PCOS）的发生，能够导致患者高雄激素血症的发生，增加了患者继发性不孕的发生风险［1］。流行病学研究发现，PCOS 的发病率可超过485/1 万人左右，同时在肥胖或者相关家族史的人群中，PCOS的发病率可进一步的上升［2-3］。卵泡发育的障碍，在影响到PCOS 的病情进展过程中具有核心的作用。不同的细胞因子，均能够影响到卵泡细胞的募集和成熟。干细胞因子（Stem cell factor，SCF）的表达上升，能够提高卵泡上皮细胞的分化成熟能力，提高卵泡细胞的定向诱导成熟程度［4］；生长分化因子-9（Growth differentiation factor-9，GDF-9）的表达，能够通过提高卵泡细胞的核基因转录激活程度，提高优势卵泡的发育成熟速度［5］；激活素（Activin，ACTA）能够通过提高颗粒细胞或者卵泡细胞膜表面的雌激素受体的敏感性，进而参与到PCOS 的病情进展过程［6］；卵泡抑素（Follistatin，FS）能够通过抑制卵泡细胞DNA 的扩增，降低卵泡细胞的富集过程，进而干预到卵泡的发育［7］。为了揭示GDF-9、SCF、ACTA 及FS 的表达与PCOS患者卵泡发育的关系，从而为临床上PCOS 患者的病情评估提供参考，本次研究选取实施体外受精治疗的PCOS 患者42 例，探讨了卵泡液体中相关因子的表达，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取林州市人民医院2017年1月至2021年4月实施体外受精治疗的PCOS 患者42 例（PCOS组），年龄平均（29.5±2.8）岁，病程（3.9±1.5）年，体质量指数（Body mass index，BMI）（24.2±2.0）kg/m2、正常排卵妇女42 例作为对照组，年龄平均（29.3±3.0）岁，BMI（24.0±2.2）kg/m2。两组研究对象的年龄、BMI 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

纳入标准：①PCOS 的诊断标准参考中华医学会制定的标准［8］；②PCOS 患者主要表现为无排卵、稀发排卵、高雄激素血症；③超声检查发现一侧卵巢中2～9 mm 的小卵泡个数≥12 个和（或）一侧卵巢体积≥10cm3；④对照组为正常排卵的妇女；⑤本研究经医学伦理委员会的批准（伦研批［2016］第14 号），所有入试者均知情并签署同意书。排除标准：①伴有全身感染性疾病；②恶性肿瘤；③具有放化疗病史、免疫治疗病史；④伴有垂体、肾上腺、甲状腺等其他内分泌系统疾病。

1.2 指标检测方法

检测两组的卵泡液中GDF-9、SCF、ACTC 及FS 水平、血清中促卵泡生成素（follicle-stimulating hormone，FSH）、雌激素（Estrogen，E2）、黄体生成素（Luteinizing hormone，LH）、孕酮（progesterone，P），并对比两组的卵母细胞体外成熟（M Ⅱ期）率、正常受精率、优质胚胎率差异。

在超促排卵后，在超声引导下进行卵泡的穿刺取卵。穿刺取卵的过程中留取一个纯卵泡液，3～5 mL，1 500 r/min 离心15 min（离心半径13 cm）收集上清液。采用贝克曼库尔特公司生产的DX800 免疫发光仪器及配套试剂进行FS 检测，采用电化学发光法检测FSH、E2、LH、P 等性激素的检测，室内质量控制符合标准。

在每个聚苯乙烯板中加入上述液体0.1 mL，4℃过夜孵育，加入磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer，PBS）洗涤3 次，每次3 min，在每个聚苯乙烯板孔中加入GDF-9、SCF、ACTC 抗体（1∶800 购自南京伯斯金生物公司），37℃孵育30 min，加入磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3 次，每次3 min，每孔中加入TMB 溶液底物0.1mL，37℃20 min，加入2M 硫酸0.05 mL 终止反应，采用DG5033A 酶标仪（南京华东电子科技公司）进行OD 值检测。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0 软件版本进行数据统计分析。本研究中符合正态分布的计量数据表述采用（±s）表示，两组间比较采用两组独立样本的t 检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义，。

2 结果

2.1 两组卵泡液中的GDF-9、SCF、ACTC 及FS 水平比较

PCOS 组患者的卵泡液中的GDF-9、SCF、ACTC 水平显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；PCOS 组患者的卵泡液中的FS 水平显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组卵泡液中的GDF-9、SCF、ACTC 及FS 水平比较（±s）Table 1 Comparison of GDF-9，SCF，ACTC and FS levels in follicular fluid of two groups of subjects（±s）

表1 两组卵泡液中的GDF-9、SCF、ACTC 及FS 水平比较（±s）Table 1 Comparison of GDF-9，SCF，ACTC and FS levels in follicular fluid of two groups of subjects（±s）

组别PCOS 组对照组t 值P 值n 42 42 GDF-9（ng/L）126.4±11.0 138.2±13.9-4.314 0.000 SCF（ng/L）21.1±4.8 23.6±4.2-2.540 0.013 ACTC（pg/mL）67.8±8.5 115.8±24.8-11.866 0.000 FS（pg/mL）1.35±0.22 1.04±0.45 4.011 0.000

2.2 两组研究对象的血清生殖激素水平比较

PCOS 组患者的血清中LH 水平显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；PCOS 组患者的血清中FSH、E2、P 水平与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 两组研究对象的血清生殖激素水平比较（±s，mU/mL）Table 2 Comparison of serum reproductive hormone levels in two groups of subjects（±s，mU/mL）

表2 两组研究对象的血清生殖激素水平比较（±s，mU/mL）Table 2 Comparison of serum reproductive hormone levels in two groups of subjects（±s，mU/mL）

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2.3 两组研究对象的卵母细胞MⅡ率、正常受精率、优质胚胎率比较

PCOS 组患者的卵母细胞MⅡ率、正常受精率、优质胚胎率显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 两组研究对象的卵母细胞MⅡ率、正常受精率、优质胚胎率比较（±s）Table 3 Comparison of oocyte MⅡrate，normal fertilization rate and high-quality embryo rate between two groups of subjects（±s）

表3 两组研究对象的卵母细胞MⅡ率、正常受精率、优质胚胎率比较（±s）Table 3 Comparison of oocyte MⅡrate，normal fertilization rate and high-quality embryo rate between two groups of subjects（±s）

组别PCOS 组对照组t 值P 值n 42 42卵母细胞MⅡ率（%）71.9±6.8 84.8±8.0-7.962 0.000正常受精率（%）64.9±5.2 73.3±7.0-6.243 0.000优质胚胎率（%）40.8±14.8 60.7±18.0-5.534 0.000

3 讨论

家族性的遗传易感基因的携带，雌激素受体敏感性的改变，均能够促进PCOS 的发生，增加远期妊娠结局的恶化风险［9］。特别是在体重指数大于28 的人群中，PCOS 的发病率可进一步的上升，其体内胰岛素抵抗、高雄激素血症的表现更为明显［10］。卵泡成熟程度或者优势卵泡的形成，能够在PCOS 的治疗过程中发挥作用，且能够在提高胚胎移植、增加宫内妊娠成功率等方面发挥作用［11］。但迄今为止临床上缺乏对于PCOS 患者卵泡发育成熟调控的相关机制研究，本次研究通过对于PCOS患者卵泡液中GDF-9、SCF、ACTC 及FS 的分析研究，不仅能够揭示PCOS 卵泡发育障碍的原因，同时还能够为临床上PCOS 患者卵泡定向诱导成熟、胚胎移植成功率的提升提供理论基础。

GDF-9 是分化诱导因子，其能够通过诱导卵泡膜细胞及其细胞质内细胞器的组装，提高卵泡细胞的成熟能力和内分泌功能。GDF-9 不仅能够影响到卵泡细胞的结构的发育成熟，同时还能够提高卵泡细胞内性激素囊泡转运机制的成熟，稳定性激素的分泌过程；SCF 是干细胞分化调控因子，其能够提高卵泡细胞核DNA 持续性自我增殖过程，提高损伤DNA 的损伤，改善卵泡细胞的无氧糖酵解及有氧氧化的能力；ACTC 的表达，能够通过激活卵泡细胞的旁分泌和内分泌的功能，提高相关卵泡细胞对于促性腺激素的敏感性，从而参与到卵泡生理功能的维持过程中；FS 作为抵抗素家族成员，其对于卵泡细胞内的c-kit 信号通路的拮抗作用，能够降低卵泡细胞对于卵泡雌激素（FSH）的敏感性，导致其发育障碍［12］。部分研究者探讨了SCF 的表达与PCOS 的关系，认为SCF的表达下降是PCOS 发生的危险性因素［4］，但对于GDF-9、ACTC 及FS 的分析研究不足。

本次研究可以发现，在PCOS 患者卵泡液体中，GDF-9、SCF、ACTC 的表的浓度明显的下降，而FS 的表达浓度明显的上升，提示了GDF-9、SCF、ACTC 及FS 的差异性表达，推测相关细胞因子的表达均影响到了PCOS 卵泡的发育过程。深入探讨GDF-9、SCF、ACTC 及FS 的表达对于PCOS 病情的影响，考虑由于其对于卵泡颗粒细胞或者膜细胞的下列影响有关［13-14］：①GDF-9 的下降影响到了卵泡膜细胞细胞壁及细胞内囊泡结构的成熟，导致优势卵泡形成障碍；②SCF、ACTC 的表达下降，不仅能够影响到优势卵泡的形成，同时还能够导致卵泡发育停滞，并影响到原始卵泡向初级卵泡的转换；③FS 的表达上升，能够阻断下游c-kit信号通路，导致下游信号通路转导障碍，进而抑制了卵泡的发育成熟。余雁等［15］研究者也发现，在PCOS 患者中，GDF-9 的表达浓度可下降35%～55%，特别是在PCOS 病程较长或者性激素紊乱较为明显的患者中，GDF-9 的表达浓度下降更为明显。PCOS 组患者的血清中黄体生成素（LH）水平显著的低于对照组，差异较为明显，提示了PCOS患者卵泡液体中存在明显的LH 的分泌障碍，LH高峰的形成异常能够导致不同阶段卵泡转化和成熟的异常，进而加剧PCOS 的病情进展程度。PCOS 组患者，其卵母细胞MⅡ率、正常受精率、优质胚胎率显著的低于对照组，提示了PCOS 组临床结局的恶化，这主要由于GDF-9、SCF、ACTC 的表达异常，导致卵泡结构和数量的异常，导致优势卵泡生理功能的丧失，进而干预到其妊娠结局。

综上所述，在PCOS 患者卵泡液体中，GDF-9、SCF、ACTC 的表达明显下降，而FS 的表达明显上升，同时PCOS 患者的卵母细胞MⅡ率、正常受精率、优质胚胎率明显下降。本次研究与国内外相关研究的创新之处在于探讨了卵泡液体中GDF-9、SCF、ACTC 的表达，而非血清中GDF-9、SCF、ACTC 的表达，相同之处在于探讨了生殖性激素水平的变化。