X连锁慢性肉芽肿病临床特征与基因诊断

郭明发 贾静 王亚峰 朱莹莹 史利欢 刘俊闪 刘炜★

慢性肉芽肿病（chronic granulomatous disease，CGD）是一种以皮肤，肺及淋巴结广泛肉芽肿性损害为特点的遗传性粒细胞杀菌功能缺陷的原发性吞噬细胞免疫缺陷病，属于单基因遗传病，多为性连隐性遗传。由于患者体内吞噬细胞编码还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶复合物的相关基因缺陷，导致中性粒细胞呼吸爆发障碍，不能有效的产生超氧阴离子（O2-）及其代谢物来杀死过氧化物酶阳性细菌和真菌［1］。X 连锁慢性肉芽肿病（X-linked chronic granulomatous disease，X-CGD）多以男性发病，女性为基因携带为特点，发病多在2 岁以内，少数可晚至10 岁以后。多数X-CGD 是由于患者CYBB基因编码区和剪接区突变引起，而非由基因调控区发生缺失引起，大多数突变影响mRNA 和（或）蛋白的稳定性，造成反复且严重感染，以及过度炎症反应的影响［2］。该病临床症状呈现多样性，容易忽视，导致临床延期诊断。故本文通过总结分析诊治的X-CGD 患者的临床特点，以及相关实验室检查，对该病进行总结，旨在帮助临床医生诊断及对患者家庭进行遗传咨询、产前诊断提供帮助。

1 研究对象和方法

1.1 研究对象

分析2015年10月至2019年5月间郑州大学附属儿童医院确诊的11 例X-CGD 患者，均为男孩，均来自河南省内不同地区。临床资料，见表1。纳入标准：所有经临床确诊的X-CGD 患者，排除标准：合并其他类型的免疫缺陷病者，以及家系成员不愿意参加本研究者。本研究获得所有患者监护人知情同意，研究经院医学伦理委员会批准。

表1 11 例X-CGD 患者的临床资料Table 1 Clinical data of 11 X-CGD patients

1.2 方法

1.2.1 病史采集及实验室检查

收集11 例患者发病时的一般临床资料、临床症状及家族史情况、实验室常规检查及病原学检查等。

1.2.2 中粒细胞呼吸爆发试验

取患者、家系成员及健康对照者新鲜静脉EDTA 抗凝血1 mL，2 h 内进行检测。处理步骤如下：①取两支流式反应管，各加入50 μL 全血，其中对照管加入50 μL 磷酸盐缓冲液（PBS），刺激管加50 μL 佛波酯（Sigma，10 μg/mL）工作液，混匀，37℃，孵育15 min；②每支反应管中分别加入25 μL 二氢罗丹明-123（Dihydrorhodamine-123，DHR-123）（Sigma，30 μg/mL）工作液，混匀，37℃避光孵育5 min；③每支反应管加入1 mL 溶血素（BD FACS Lysing Solution），室温避光10 min；④400 g，离心5 min，弃上清，PBS 洗涤2 次，离心弃上清，加200 μL PBS 上机检测。本实验采用FACSCantoⅡ流式细胞仪（BD 公司，美国），以对照管调节仪器电压，设置阴性区间，采用BD Diva软件分析刺激管检测发出阳性信号的细胞比例，报告中性粒细胞活化率即阳性信号的粒细胞占全部粒细胞的比例。

1.2.3 基因测序

对所有患者及其家系成员进行基因诊断，采集静脉EDTA-K2抗凝血2 mL，送至北京迈基诺医学检验所进行Sanger 测序。

2 结果

2.1 中性粒细胞活化率分析

11 例患者及家系成员均行中粒细胞呼吸爆发试验检查，其中所有患者中性粒细胞活化率均＜10%；其中6 例患者母亲呈携带者双峰表型（例1、3、4、5、9、10），3 例患者姐姐也呈现携带者表型（例3、9、10），而患者父亲中性粒细胞活化率呈现正常阳性信号。见表2、图1。

表2 11 例X-CGD 患者级家系成员的中粒细胞活化率及基因突变Table 2 Neutrophil activation rate and gene mutations of 11 X-CGD patient-level family members

图1 例10 X-CGD 患者及家系成员中性粒细胞活化率分析Figure 1 Analysis of neutrophil activation rate of 10 X-CGD patients and family members

2.3 基因测序结果

经Sanger 测序分析，所有患者均显示为CYBB基因突变，其中自发突变5 例（例2、6、7、8、11），母系来源突变6 例（例1、3、4、5、9、10），典型基因分析来自10 号病例，患者呈现CYBB基因半合子变异、患儿父亲无变异、患儿母亲及姐姐呈现杂合变异。见表2、图2。

图2 例10 X-CGD 患者及家系成员基因诊断分析Figure 2 Genetic diagnosis analysis of 10 X-CGD patients and family members

2.4 家系分析

X-CGD 患者为先症者，其CYBB基因突变来自母亲，由母亲X 染色体遗传，其中女儿为携带者，男性多发病，典型家系分析来自10 号病例。见图3。

图3 例10 X-CGD 患者遗传家系分析Figure 3 Analysis of the genetic family of 10 X-CGD patients

2.5 随访结果

本研究中11 例患者中，1 例患者以“溃疡性结肠炎”反复多次就诊多家医院，出生9 天即起病，1 岁9月在本院第二次入院通过中性粒细胞活化率筛查为疑似病例，经基因诊断确诊。3 例患者死亡，其中2 例在他院经历较长时间抗感染治疗，入院明确诊断时已进入感染终末期阶段。8 例存活患者中，其中2 例经造血干细胞移植治疗后检测中性粒细胞呼吸爆发功能正常，中性粒细胞活化率＞90%；其余6 例经控制感染后暂时存活。

3 讨论

慢性肉芽肿是一种少见的遗传性疾病，可分为X-CGD 和常染色体隐性遗传CGD。其发病率约为1/20 万人，欧美国家报道发病率大约1/25 万～1/20 万［3］，目前我国尚无确切的发病率数据报道。由于患者体内NADPH 氧化酶复合物的某些成分缺失或减少，不能有效地产生具有杀菌活性的超氧阴离子及其代谢产物，从而吞噬细胞无法产生“呼吸爆发”，导致机体对多种病原体感染无法清除，造成过氧化氢酶阳性细菌，侵袭性真菌，结核分枝杆菌等感染［4-6］。CGD 患者常以肺部感染为主要表现，包括肺炎与肺脓肿，其他症状包括淋巴结炎、皮肤和胃肠道感染［7-8］。本组中10 例（90.9%）患者以肺炎为主要病因入院，且以新生儿期起病为主，年龄低于国内已有报道［9］，且患者从发病到诊断时间明显缩短，可能与该疾病的快速筛查意识提高有关系。

NADPH 氧化酶复合物是由5 个吞噬氧化酶phox 亚基组成的多组分酶［10］，5 个吞噬氧化酶亚基gp91、p22、p47、p67 和p40 的编码基因分别CYBB、CYBA、NCF1、NCF2、NCF4。其中CYBB基因缺陷常引起引起X-CGD，表现为男性患病，女性携带。CYBB基因突变在欧洲和美国报道比例分别为67%、70%［5］，国内上海和重庆报道比例为89.1%、83.3%［2，6］。

CGD 实验室传统诊断依赖硝基四唑氮蓝（Nitro blue tetrazolium chloride，NBT）还原实验，存在操作复杂、繁琐且结果不客观等缺点［10］，20世纪90年代后期，DHR-123 经流式细胞术测定细胞内活性氧开始应用于临床。无荧光染料DHR-123，进入中性粒细胞后，可被中粒细胞呼吸爆发过程产生的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）氧化为荧光物质DHR-123，发出荧光，被流式细胞仪捕获，可直接反映中性粒细胞的活化能力［11］。健康人群中性粒细胞活化在检测图上呈现显著的阳性位移群，而X-CGD 患者几乎没有移位；且X-CGD携带者中粒细胞存在两个不同群体即部分正常位移，部分没有位移，呈现双峰表型［12］。本研究中11例X-CGD 患者中粒细胞活化率均＜10%，且检测图上几乎无位移。研究显示X-CGD 携带者中粒细胞活化率范围在20%～80%，极少情况下只有10%中粒细胞活化率也具有正常的宿主防御能力［13］。本研究的家系成员中粒细胞呼吸爆发试验显示：6 例患者母亲中粒细胞活化率在14.2%～59.6%之间；3 例患者同胞姐姐中粒细胞活化率38.6%～63.1%之间，患者父亲均呈现典型的阳性位移群。采用流式细胞术检测中性粒细胞活化率，有助于快速筛查X-CGD 患者，但其明确诊断仍需要基因诊断。

综上所述，X-CGD 临床起病早，反复重症感染常见，由于临床病例少见，易被忽视。随着流式细胞仪在基层医院的普及，采用流式细胞术-DHR 检测能简单快捷检测中性粒细胞活化率，对于低年龄起病的过氧化氢酶阳性菌感染、真菌感染、卡介苗接种异常等疑似CGD 患者，建议开展检测中粒细胞呼吸爆发实验。目前遗传性疾病，尤其是单基因遗传病的临床确诊需要采用基因诊断，主要技术有基于PCR 扩增技术和基因测序技术等［14-15］，明确单基因遗传病的临床诊断需对患者及其家系成员进行基因分析，明确其遗传方式，同时对家系中基因携带者进行必要的遗传咨询和产前诊断，对避免基因缺陷儿的出生，提供优生优育的指导策略。