LSG1基因在乳腺癌中的表达及临床意义

姜芳倩，路剑飞，姚廷敬，李煊赫，孙思雨，曹易凡，孟盛雯

近年来，女性乳腺癌的发病率急剧上升，疾病负担也日益增加，已成为全球重点公共卫生问题[1]。虽然乳腺癌预后较差，临床上治疗乳腺癌也取得了一些进展，如赫赛汀、吡咯替尼等靶向药物的使用，但仍然不能满足需求。其中最主要的原因是缺乏特异性靶点，以及患者异质性等导致的治疗抵抗。LSG1是一种蛋白编码基因，参与60S大亚基的活化及核糖体生物合成[2],而研究[3]发现核糖体生物合成与乳腺癌发生发展相关,最新研究提出LSG1作为衰老癌症治疗的候选靶点，可能具有很高的潜力。基于细胞学数据挖掘和分子实验、癌症基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)等高通量数据泛癌症分析首次发现包括乳腺癌在内的六种肿瘤中LSG1基因高表达，且不利于乳腺癌患者预后[4-5]。以上提示LSG1基因高表达，可能参与乳腺癌发生或进展。因此提出假说：LSG1基因在乳腺癌患者中高表达与疾病进展和预后相关。本研究旨在通过QRT-PCR、WB检测LSG1在乳腺癌患者癌组织和癌旁组织中的表达水平，进而分析其临床意义。

1 材料和方法

1.1 材料 选取2020年7月—2021年4月蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科入院手术且术前未接受任何治疗的患者术中癌组织及癌旁组织标本，癌旁正常组织取距离肿瘤5 cm的组织。所有患者的新鲜癌组织及癌旁标本置于试管中标记完成后，在30 min内放入-80 ℃超低温冰箱中冷冻保存,2021年5月进行实验。本次研究15例女性患者的年龄在37～69岁，中位年龄53岁；绝经前患者3例，绝经后12例；均无家族性遗传肿瘤病史，肿瘤大小<5 cm，均未发生远处转移。收集患者基本资料，所有患者均签署知情同意书，已获得我院医学伦理委员会批准(伦理编号：伦科批字[2021]第278号)。

1.2 主要试剂 试剂盒购自北京艾德莱生物公司；热稳定逆转录酶购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；核糖核酸酶抑制剂购自北京迈瑞达科技有限公司；50倍浓度荧光定量PCR参比染料及SYBR荧光染料购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；Taq酶及DL2000DNA标记物购自北京天根生化科技有限公司；引物合成由擎科公司完成；磷酸酶抑制剂、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自碧云天；PMSF购自阿拉丁公司；蛋白marker(14-120KD)购自北京全式金生物技术有限公司；PVDF膜(0.45μm)由Millipore公司合成；β-actin抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；兔多抗LSG1购自三鹰公司；HRP标记羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；ECL底物液购自北京普利莱基因技术有限公司。

1.3 QRT-PCR实验方法 Trizol法提取RNA(检测RNA浓度和纯度时,A260/A280比值需在1.9～2.1之间)，按照说明书规定的反应条件将提取的RNA逆转录成cDNA，然后再进行半定量RT-PCR检测，最后进行QRT-PCR检测。PCR定量时每组设3个复孔，计算复孔的Ct平均值，按照相对定量计算公式得到相对定量结果。整体以GAPDH为内参进行引物反应。见表1。

表1 引物序列

1.4 WB实验方法 取6例乳腺癌患者的癌组织及其配对癌旁正常组织，液氮研碎，组织强裂解液进行裂解，提取总蛋白，进行蛋白质浓度测定。见表2。蛋白质变性后，制备电泳胶，进行电泳分离、电转移，将PVDF膜浸泡在含5%脱脂奶粉的TBST(封闭液)中，室温摇床，封闭2 h，PVDF膜浸泡在一抗孵育液中，4 ℃孵育，过夜。PVDF在二抗孵育液中，37 ℃下，摇床孵育2 h。最后，将ECL试剂中增强液，滴加在于PVDF膜上，充分反应后，用X光胶片压片后扫描，用BandScan分析胶片灰度值。

表2 蛋白质定量 (μg/μL)

2 结果

2.1 QRT-PCR检测结果 乳腺癌组织中LSG1的表达水平高于对照癌旁组织，但癌组织中数据波动较大，体现在组间标准差(误差线)较大，差异无统计学意义。见图1。而LSG1在14例癌旁组织中的表达比较稳定，而在癌组织中的表达呈两端分布，出现两个表达较高的值，导致整体上乳腺癌癌组织中的表达高于癌旁组织，以及数据标准差较高。见图2。

图1 LSG1在乳腺癌癌和癌旁中的mRNA表达水平

图2 LSG1在每例患者乳腺癌癌和癌旁组织中的mRNA表达水平

2.2 WB检测结果 由免疫印迹条带图可知LSG1蛋白在乳腺癌癌组织表达水平明显高于对应癌旁组织。见图3。在癌旁组织中LSG1蛋白相对于β-actin蛋白表达均值为0.44，而在癌组织中均值为3.04，乳腺癌组织中LSG1蛋白表达明显增加，且高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.01)。见图4。

注：1，3，5，7，9，11为癌旁组织，2，4，6，8，10，12为对应癌组织图3 癌组织与癌旁组织免疫印迹条带图

图4 LSG1在乳腺癌组织和癌旁组织中的蛋白表达水平比较

3 讨论

乳腺癌已成为全球第一大癌，相关研究[6]发现其发展与核糖体生物合成相关，核糖体生物合成促进乳腺癌的生长和增殖，同时也促进了上皮间充质转化，促进乳腺癌的侵袭[7]，靶向抑制核糖体生物合成是目前研究抑制乳腺癌进程的热点[8]。目前已有6种GTP酶参与核糖体的生物发生，其中LSG1和EFI1连续作用于60S核糖体亚基的最后细胞质成熟步骤[9]，LSG1介导核糖体生物合成,调控多种细胞生物学进程。LSG1基因即60S大亚基出核转运GTP酶1，是一种编码蛋白质的基因，分布广泛，主要位于内质网中，具有多种生物学功能。LSG1蛋白参与细胞质前体60S大亚基的转运和组装过程[10]，抑制LSG1表达可诱导一系列的内质网破坏和细胞衰老[3]。LSG1、BRX-1以及转录因子MYC1能够共同调控拟南芥中核糖体的生成，进而发挥细胞生物学调控作用[11]。60S大亚基能结合在Nmd3同源物(nmd3 homolog，Nmd3)、LSG1和Tif6复合体上，而Nmd3结合在LSG1则可进一步激活LSG1的酶活性，参与60S大亚基的活化及核糖体生物合成[12]。

本次研究QRT-PCR未能得出明显阳性结果可能与肿瘤异质性、个体差异性等相关。乳腺癌因基因组学、转录组学和微环境不同，导致不同表型和生物学行为差异，正确认识异质性对临床诊断、制定方案及判断预后很重要[13]。目前已知肿瘤内部可能存在明显的异质性，瘤内异质性可分为三大类：遗传、表型和微环境[14]。乳腺癌的异质性导致了不同分子亚型，STO-3试验提示，肿瘤组织内部ER表达异质性，是内分泌治疗敏感性的独立预测因子，高异质性ER+患者长期生存率明显降低[15]。本次研究PCR检测LSG1表达比较高的一例患者ER(2+),以及Ki-67为30%等这些因素均提示患者预后不良，而根据术后随访，患者2021年5月8日胸部CT提示两肺多发小结节，转移待排，也确实表明患者预后不良，这些都在提示LSG1基因高表达与预后不良相关。虽然本次研究QRT-PCR检测结果在乳腺癌癌组织中波动较大，组间标准差较大，差异无统计学意义，但是总体表达是高于癌旁组织的，仍不可忽视这一结果。

WB检测结果提示LSG1蛋白在乳腺癌癌组织中的表达均高于癌旁组织，而LSG1主要位于内质网中，抑制LSG1表达可诱导一系列的内质网破坏和细胞衰老[3]。实现复制和癌基因诱导的衰老反应的两个主要途径是p16/视网膜母细胞瘤(RB)和p53途径[16]，相关研究[3]证实LSG1参与RB、p53途径可能作为衰老癌症治疗的候选靶点，而RB蛋白作为肿瘤抑制基因，RB-E2F信号通路的激活能够促进细胞周期中的G1/S期转化，促进细胞生长[17]，RB蛋白已被证实参与乳腺癌细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(cyclin-dependent kinases 4 and 6，CDK4/6)信号通路[18-19]，相关CDK4/6小分子抑制剂如帕博西利、阿贝西利等已被批准上市，治疗转移性激素受体阳性乳腺癌[20]。p53作为主要的抑癌基因，为异常细胞的增殖抑制剂和消除器，抑制肿瘤增长[21]，p53基因突变是人类肿瘤中如乳腺癌最常见的遗传变化[22]，p53在乳腺癌组织中高表达而且累计越多提示乳腺癌恶性程度越高[23]。

本次研究LSG1蛋白的表达选用WB技术，明确分析了LSG1蛋白在乳腺癌癌组织中的表达高于癌旁组织，虽然样本量较少，仅选用6例乳腺癌患者的癌组织及癌旁正常组织，但最后结果显示，P值小于0.01，差异有统计学意义。根据术后随访，WB检测的6例患者术后病理均为浸润性癌，有2例三阴性乳腺癌、2例管腔B型乳腺癌、2例HER2阳性型乳腺癌，Ki-67指数均为高表达(Ki-67指数以15%为界)，其中Ki-67指数最高的一例患者为80%，是三阴性乳腺癌。6例患者中分别有1例HER2阳性乳腺癌、1例管腔B型乳腺癌腋窝淋巴结均为阳性，已根据指南进行治疗。据目前随访，患者未出现复发或转移，5、10年的疾病无进展生存率、总体生存率等需后续跟踪随访。三阴、HER2阳性、Ki-67指数高等这些指标均提示患者预后不良。Ki-67作为增殖活性细胞核内表达核抗原，由MKI67基因编码[24]，可用于判别患者肿瘤程度、进展和预后，且比其他任何预测因素都准确。Ki-67可以预测早期雌激素受体阳性乳腺癌的预后，尤其在管腔B型乳腺癌中，Ki-67表达水平显著升高[25]。Mushtaq等[26]研究提出，高Ki-67与组织学分级、淋巴结/远处转移等病理参数显著相关，Ki-67的高表达也与ER、PR和HER2密切相关，其中98%的HER2阳性和95%的三阴性乳腺癌患者中，Ki-67指数也显著增高，其高表达在三阴性乳腺癌中提示预后不良。故根据文献报道及本次研究，LSG1蛋白在乳腺癌癌组织中高表达，且与预后不良相关。

查阅相关文献，目前并未发现LSG1与乳腺癌或其他恶性肿瘤相关基础或临床研究，仅查阅到LSG1与核糖体生物合成相关及在其他基础领域方面的研究。因此本研究是第一次尝试研究LSG1在乳腺癌中的表达，其作用不可忽视。LSG1高表达可能参与乳腺癌的增殖并提示预后较差，本次研究具有广泛而深远的意义。

综上，本次研究验证了LSG1在乳腺癌癌组织中基因和蛋白水平高表达，且与患者预后不良相关，后续可通过分子实验、动物试验等揭示乳腺癌中LSG1基因可能参与的分子机制，使其可能作为乳腺癌诊断和治疗的靶点，为新药研制提供方向。