间作桃树对石榴枯萎病土壤真菌多样性的改善研究

周银丽，韦福翠，张德刚，杨 伟，胡先奇

(1.红河学院云南省高校滇南特色生物资源研究与利用重点实验室，云南 蒙自 661100; 2.红河学院商学院，云南 蒙自 661100; 3.云南农业大学农业生物多样性与病害控制教育部重点实验室，昆明 650201)

【研究意义】蒙自享有石榴之乡的美名[1]，但是随着果树年龄的增长，病害危害的程度也大幅度增加，传统耕作轮换制度对于多年生的果树不切实际，化学农药的大量使用与产品的品质和土壤微生态平衡又相矛盾[2]，严重限制了石榴产业的可持续发展。【前人研究进展】传统的间作、套作方式在调整产业结构，提高经济效益等方面的作用得到广泛认可[3]，可以起到增产、提高养分资源利用率、增加农田生物多样性的作用[4]，间作可提高石榴枯萎病土壤的微生物群落碳代谢的能力，对石榴枯萎病害土壤有一定的修复作用[5]，并且向着高肥力的方向发展[6]，同时大量的研究表明间作可以改变土壤真菌和细菌的群落结构[7]，促进微生物群落向更好的趋势发展[8]。已有研究表明石榴枯萎病病菌主要从伤口侵入石榴根部[9]，进而在木质部扩展危害，所以石榴根际微生物对枯萎病的传播蔓延影响尤为重要。石榴枯萎病是一种土传真菌病害，病原菌甘薯长喙壳菌(Ceratocystisfimbriata)在土壤中分布广泛，主要引起甘薯黑斑病、石榴枯萎病[10]。自1999年在中国云南省蒙自县爆发石榴枯萎病以来[11]，相关的防治研究就在不断探索中[12-13]。【本研究切入点】土壤微生物群落结构及其功能是影响连作障碍的重要因素，石榴园土壤微生物群落及其功能是解析石榴连作障碍的关键因素。【拟解决的关键问题】利用高通量测序的方法研究蒙自石榴枯萎病土壤样品(MZD)、间作桃树修复石榴枯萎病根际土壤(MZP)、蒙自健康石榴土壤样品(MZ)的真菌多样性，比较健康石榴根际真菌与石榴枯萎病根际真菌及间作桃树修复石榴枯萎病根际真菌多样性的差异，初步探索通过间作桃树改变石榴园的真菌生物多样性控制石榴枯萎病的机理，为开展微生态调控土传病害的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 石榴根际土样的采集

石榴根际土样采集方法同文献[12]。

1.2 石榴根际土壤基因组DNA的提取及文库构建

用OMEGA试剂盒提取土壤基因组DNA，PCR扩增土壤真菌 ITS1区，引物ITS5-1737F：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′；ITS2-2043R：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。PCR产物用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测并回收。构建好的文库检测合格后使用MiSeq进行上机测序。

1.3 数据分析方法

对Illumina MiSeq测序平台得到的数据进行预处理，除去干扰分析的低质量数据，得到最终的有效数据(Effective Tags)[14-16]。基于有效数据(Clean Data)进行系列分析。

2 结果与分析

2.1 3种类型根际土壤真菌的OTU分析及物种注释

基于OTUs中的序列数据进行物种注释分析[17]，统计每个样品在各分类水平上的序列数目，3种土壤MZD、MZ、MZP在界水平上的平均序列数目分别为35 697、37 048、34 888；MZD、MZ、MZP在门水平上的平均序列数目分别为32 865、34 698、28 714；MZD、MZ、MZP在纲水平上的平均序列数目分别为31 119、30 723、27 622；MZD、MZ、MZP在目水平上的平均序列数目分别为31 117、30 722、27 622；MZD、MZ、MZP在科水平上的平均序列数目分别为30 996、30 617、27 051；MZD、MZ、MZP在属水平上的平均序列数目分别为30 901、30 514、27002。

基于物种注释结果，最大相对丰度排名前十的科(Family)分别是：丛赤壳科(Nectriaceae)，Un--s-Fungi sp，Un--s-Ascomycota sp MA5351，毛壳菌科(Chaetomiaceae)，肉座菌科(Hypocreaceae)，发菌科(Trichocomaceae)，被孢霉科(Mortierellaceae)，Un--s-Trechisporales sp，Un--s-Ascomycota sp，Un--s-Xylariales sp。生成的物种相对丰度分布柱形图见图1，其中丰度较高的是丛赤壳科，约占25%。

图1 科水平上丰度前10的物种相对丰度

根据OTUs聚类分析结果，3种不同土壤样品之间OTUs的特有、共有信息用韦恩图展示(图2)。枯萎病石榴土壤(MZD)、健康石榴土壤(MZ)、间作桃树修复石榴枯萎病根际土壤(MZP)的OTUs数分别为1174、1076、1007个，健康石榴土壤(MZ)特有OTUs数为47个，间作桃树修复石榴枯萎病根际土壤(MZP)特有OTUs数为94个，枯萎病石榴土壤(MZD)特有OTUs数为152个，枯萎病石榴土壤(MZD)、健康石榴土壤(MZ)、间作桃树修复石榴枯萎病根际土壤(MZP)共有的OTUs数为635个。

图2 不同类型土壤真菌的韦恩图

2.2 3种类型根际土壤真菌微生物多样性及物种丰度聚类

2.2.1 门水平上3种类型根际土壤真菌多样性 MZP、MZD、MZ 3种根际土壤真菌多样性在门水平上的丰度比较见图3，MZP3中Un--s-fungal_endophyte sp AP853、Un--s-Fungi_sp、球囊菌门(Glomeromycota)相对丰度较高，Un--s-fungal_endophyte、子囊菌门(Ascomycota)、Un--s-fungal_sp 7 RU025相对丰度较低；MZP1中担子菌门(Basidiomycota)、Un--s-fungal_endophyte sp AP853、Un--s-fungal_sp WEF9相对丰度较高，子囊菌门(Ascomycota)、Un--s-fungal_sp 7 RU025、Un--s-fungal_sp F490a相对丰度较低；MZP2中Un--s-fungal_endophyte sp ECD_2008、Un--s-fungal_endophyte、Un--s-fungal_endophyte sp AP053相对丰度较高，Un--s-fungal_sp 7 RU025、接合菌门(Zygomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)相对丰度较低；MZ3中Un--s-fungal_sp ARIZ AZ0515、Un--s-fungal_sp F174、Un--s-fungal_sp TRN436相对丰度较高，Un--s-fungal_sp F308、Un--s-fungal_endophyte、Un--s-fungal_sp KRP24相对丰度较低；MZD3中Un--s-fungal_sp NLR_2013、Un--s-fungal_sp FF_2011、Un--s-fungal_endophyte相对丰度较高，Un--s-fungal_sp F490a、Un--s-fungal_sp F174、Un--s-fungal_sp TRN436相对丰度较低；MZD2中Un--s-fungal_sp KRP24、Un--s-root_associated_fungal sp EP1_6、Un--s-fungal_endophyte sp SS_1519相对丰度较高，Un--s-fungal_sp F490a、Un--s-fungal_sp WEF9、Un--s-fungal_sp TRN436相对丰度较低；MZD1中Un--s-fungal_sp F308、Un--s-fungal_sp ASR_213、Un--s-fungal_sp F490a相对丰度较高，Un--s-fungal_sp F174、Un--s-fungal_endophyte sp AP853、Un--s-Fungi_sp相对丰度较低；MZ2中Un--s-Rickiella_edulis、Un--s-fungal_sp ARIZ L453、Un--s-fungal_sp ASR_213相对丰度较高，Un--s-fungal_sp FF_2011、Un--s-fungal_sp F308、Un--s-fungal_sp F174相对丰度较低；MZ1中子囊菌门(Ascomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、Un--s-fungal_sp 7 RU025相对丰度较高，Un--s-fungal_sp KRP24、Un--s-fungal_endophyte sp AP053、Un--s-fungal_sp WEF9相对丰度较低。

图3 门水平上3种类型根际土壤真菌的物种丰度聚类图

2.2.2 属水平上3种类型根际土壤真菌多样性 在属的分类水平，共鉴定到481属真菌，对3种类型土壤鉴定到的真菌属进行统计分析，结果表明，3种类型土壤的真菌在属的分类水平上存在显著差异性：石榴枯萎病根际土壤(MZD)与间作桃树修复枯萎病石榴土壤(MZP)差异显著的真菌属有47个:包括Un--s-Fungisp.，Un--s-Chaetomiaceaesp.，Fusicolla，Un--s-Mortierellalessp.，Un--s-Hypocrealessp.，Un--s-Lasiosphaeriaceaesp.，Remersonia，Un--s-Herpotrichiellaceaesp.，Un--s-Microascalessp.，翅孢壳属(Emericellopsis)，壳针孢属(Septoria)，腐质霉属(Humicola)，葡萄穗霉属(Stachybotrys)，Wardomycopsis，透孢黑团壳属(Massarina)，Stagonosporopsis，被孢霉属(Mortierella)等;间作桃树修复石榴枯萎病土壤(MZP)与蒙自健康石榴土壤样品(MZ)真菌差异显著的属有21个：Fusicolla，Un--s-Hypocrealessp.，Un--s-Cordycipitaceaesp.，Un--s-Microascalessp.，壳针孢属(Septoria)，腐质霉属(Humicola)，葡萄穗霉属(Stachybotrys)，透孢黑团壳属(Massarina)，Stagonosporopsis，被孢霉属(Mortierella)等(表1)。

表1 属水平上3种类型根际土壤真菌多样性部分统计

2.3 3种类型土壤根际真菌群落组成的主成分分析

为了能够更加直观地揭示在石榴园枯萎病发生区间作桃树对土壤真菌群落组成结构的影响，用PCA(Principal Component Analysis，PCA)分析了3种类型土壤根际真菌群落组成[18]，结果见图4，对样品差异的贡献值第一主成分为24.54%，第二主成分为15.71%，栽种桃树修复石榴枯萎病根际土壤(MZP1、MZP2、MZP3)的真菌微生物群落组成基本聚在了一起，群落组成较相似；健康石榴根际土壤样品(MZ1、MZ2、MZ3)的真菌微生物群落组成距离较近，也基本聚在了一起；3个石榴枯萎病根际土壤样品(MZD1、MZD2、MZD3)的真菌微生物群落组成差异相对较大，在PC2轴上的距离相对较远，分析原因可能与3个土壤样品采样地域跨度较大有关。土壤真菌群落组成在石榴枯萎病根际与栽种桃树修复石榴枯萎病根际组成差异较大，在PC1轴上距离相对较远。PCA的分析结果说明，间作桃树能较大程度改变石榴枯萎病根际土壤真菌的群落组成。

图4 3种土壤真菌的 PCA 分析

3 讨 论

已有的研究表明，病害发生在一定程度上受土壤微生物群落结构变化的影响[19]，病菌侵染甚至可通过改变相对丰度和菌种组成影响根系内生菌根真菌群落结构[20]。利用高通量测序方法研究土壤根际真菌多样性近年来有较多报道，杨光柱等[21]分析了苹果树土壤根际真菌多样性，结果表明患病土样中部分有益菌低于健康土壤，苹果根腐病病原菌高于健康土壤，说明根际土壤真菌群落的平衡被打破会影响土壤的健康。王琪等[22]分析了间作蚕豆与单作羌活根际土壤微生物活性，结果表明蚕豆间作有效改善土壤微环境，促进羌活次生代谢产物的积累，提高羌活药材产量和质量，有研究表明小麦蚕豆间作能不同程度增加小麦、蚕豆生物量和磷素吸收累积[23]，提高土壤微生物代谢活性[24]，甘蔗玉米间作可提高土壤微生物多样性[25]，西瓜套作大蒜对西瓜有一定的促生作用，且减少了西瓜枯萎病发病率[26]，玉米大豆带状套作体系中，植株氮、磷、钾养分吸收总量比相应单作提高，带状套作提高了玉米大豆对养分的吸收利用，有套作产量优势[27]，间作能改善栀子根际微生物群落结构，同时提高土壤综合肥力[28]。之前的研究表明石榴根际细菌的多样性间作桃树之后也得到了改善[12]，本文的研究表明真菌群落组成在间作桃树修复石榴枯萎病根际土壤(MZP)与石榴枯萎病根际土壤样品(MZD)之间差异较大，在属的分类水平上，2种类型土壤有47个属的真菌存在显著差异，说明石榴枯萎病根际的真菌多样性及土壤微生态平衡能通过间作桃树得到改善。

4 结 论

真菌群落组成在间作桃树修复石榴枯萎病根际土壤(MZP)与石榴枯萎病根际土壤(MZD)之间有差异较大，石榴枯萎病根际土壤真菌的群落组成通过间作桃树能较大程度改变。3种类型根际土壤共鉴定到481种真菌属，间作桃树修复石榴枯萎病土壤(MZP)与蒙自健康石榴土壤样品(MZ)真菌差异显著的属有21个:壳针孢属(Septoria)，腐质霉属(Humicola)，葡萄穗霉属(Stachybotrys)，透孢黑团壳属(Massarina)，Stagonosporopsis，被孢霉属(Mortierella)等。石榴石榴枯萎病根际土壤(MZD)与间作桃树修复石榴枯萎病土壤(MZP)差异显著的真菌属有47个:翅孢壳属(Emericellopsis)，壳针孢属(Septoria)，腐质霉属(Humicola)，葡萄穗霉属(Stachybotrys)，Wardomycopsis，透孢黑团壳属(Massarina)，Stagonosporopsis，被孢霉属(Mortierella)等。2种根际土壤中的真菌差异显著，说明在石榴枯萎病发生园区土壤真菌的群落组成及多样性能通过间作桃树得到改善，为应用间作桃树改善石榴枯萎病土壤的真菌多样性控制石榴枯萎病的发生及扩散提供的参考。