敲低lncRNA SNHG7通过抑制ROCK1降低前列腺癌细胞增殖和迁移能力

佟丽斐，张霞，杨玉蝶，李起征，刘鹏

（大连医科大学 1.附属大连市第五人民医院放疗科，辽宁 大连 116021；2.附属大连市第五人民医院肿瘤内科，辽宁 大连 116021；3.附属第一医院肿瘤科，辽宁 大连 116011；4.附属大连市中心医院肿瘤内科，辽宁 大连 116033）

前列腺癌是一种危及生命的男性恶性肿瘤，2018年约新增130万例，死亡35.9万人［1］。尽管随着诊断和治疗的不断进展，患者的生存时间极大延长，但部分高度恶性患者的5年总生存率仍很低［2］。因此，研究前列腺癌恶性发生、发展的分子机制，有助于临床减缓甚至抑制前列腺癌的恶性进展。近年来，大量证据证实长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在前列腺癌中发挥关键作用［3-4］。lncRNA可以竞争性结合微RNA，或作为桥接分子与其他功能蛋白形成功能复合体，从而调控肿瘤生长、转移过程关键基因的表达［3］。最近研究［5-7］发现，lncRNA小核仁RNA宿主基因7（small nucleolar RNA host gene 7，SNHG7）在多种肿瘤中呈异常高表达，而SNHG7异常高表达与乳腺癌、肺腺癌、胶质瘤的不良预后相关。尽管近期有研究［8］发现SNHG7在前列腺癌中高表达，但SNHG7在前列腺癌恶性进展中的功能仍有待进一步探索。

Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶1（Rho-associated coiled-coil domain containing protein kinase 1，ROCK1）是转化生长因子β/Smads信号通路调控因子，编码一种蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶，当与Rho的鸟苷三磷酸结合时将被激活［9］。前期研究［10］表明，ROCK1参与多种疾病的发病过程。此外，ROCK1在多种肿瘤的发病机制中发挥重要作用，激活ROCK1信号通路已被证实可促进胰腺癌细胞的侵袭和转移［10］，ROCK1还可通过抑制PTEN/FAK通路促进非小细胞肺癌的发生、发展［11］。尽管已经在多种肿瘤中明确其作用，但ROCK1在前列腺癌中的具体调控机制尚不清楚。本研究通过Western blotting、Transwell实验、荧光原位杂交实验等深入探讨SNHG7对前列腺癌细胞的恶性调节能力及可能机制，从而为前列腺癌的治疗提供有效策略。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人正常前列腺上皮细胞系RWPE、前列腺癌细胞系PC-3购自中国科学院上海分院，细胞培养于RPMI 1640培养基（北京赛默飞），并添加10%胎牛血清（美国Gemini Bio-Products）和100 U青霉素和链霉素双抗（北京索莱宝）。VCaP和DU145细胞培养于DMEM培养基，并添加10%胎牛血清和100 U青霉素和链霉素双抗。细胞于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2 转染

使用Lipofectamine 3000试剂盒（美国Invitrogen）转染SNHG7，根据说明书进行操作。SNHG7敲低质粒和ROCK1过表达质粒由上海吉玛公司合成（si-NC和pcDNA3.1分别为敲低和过表达空白载体，即阴性对照组）。细胞生长融合度达到90%时进行传代，传代按照1 ∶3比例进行。待细胞生长铺满皿底50%左右进行转染，转染过程根据说明书添加Lipofectamine 3000和P3000，转染后6 h换液，换液后24～48 h进行PCR检测，48～72 h进行Western blotting。SNHG7敲低序列（si-SNHG7）：5’-GCUGGAAUAAA GAGUAACAUU-3’；阴性对照（si-NC）序列：5’-UU CUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。

1.3 MTT实验

将5×103个细胞置于96孔板中，37 ℃培养。待细胞进行SNHG7转染后，每孔加入10 μL MTT溶液，于37 ℃孵育4 h。在490 nm处测定各样品的分光光度。所有实验重复3次，计算平均值。

1.4 Transwell实验

通过Transwell实验（美国Costar）体外评估前列腺癌细胞的侵袭和迁移能力。细胞转染后，将1×105个细胞接种于上室，并加入300 μL 培养基，下室加入等量培养基。48 h后擦除膜表面的细胞，使用甲醛固定20 min，随后PBS清洗3遍，最后用0.5%结晶紫染色。在显微镜下随机分为5个区，计数浸润和迁移细胞数目。

1.5 总RNA提取和PCR

按照说明书使用TRIzol试剂分离总RNA。使用PrimeScript试剂盒（日本TaKaRa），根据说明书进行逆转录和实时PCR。使用SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ在Bio-Rad CFX 96实时PCR系统上进行实时PCR。GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法测定基因相对表达量。引物序列：SNHG7，正义5’-GTTGGGGTGTTGGCAT TCTTGTT-3’，反 义5’-GCGCCCAATACGACCAAAT C-3’；ROCK1，正 义5’-CTGCAACTGGAACTCAACC AAGAA-3’，反 义5’-TTAGCACGCAATTGCTCAATA TCAC-3’；GAPDH，正义5’-CGTCGCTAGCGATCGT TACA-3’，反义5’-CTAAATGCTAGTCTTTACGA-3’。

1.6 Western blotting

将SNHG7转染后的前列腺癌细胞溶解于含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液。蛋白（20 μg）经过10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到聚偏二乙烯膜上。使用针对ROCK1（中国CST公司）和GAPDH（中国CST公司）的一抗进行孵育，4 ℃过夜，翌日TBST清洗，每次5 min；随后荧光二抗室温孵育2 h（中国CST公司）。使用增强化学发光试剂进行发光成像（型号：FD8020，杭州富德生物科技有限公司）。

1.7 荧光原位杂交实验

将细胞均匀铺在6孔板中，使用4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗3次，每次5 min；随后使用甘氨酸处理5 min，PBS再次冲洗5 min；使用0.5% Triton-100对细胞进行透膜10 min；PBS清洗3次，每次3 min；滴加杂交液预处理1 h，然后使用生物素标记的SNHG7探针（武汉塞维尔）进行细胞孵育，4 ℃过夜；抗生物素抗体（北京赛默飞）进行杂交过夜，最后滴加荧光二抗（北京CST），进行DAPI（北京碧云天）显色。

1.8 统计学分析

采用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析。每个实验重复3次，结果以表示。采用t检验进行2组间比较。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SNHG7在前列腺癌中高表达并提示预后不良

为了分析SNHG7在前列腺癌中的表达，首先通过癌症基因组图谱数据库（http：//gepia.cancer-pku.cn）对其进行癌和癌旁组织表达差异分析。结果显示，SNHG7在前列腺癌组织中高表达（图1A）。此外，生存分析提示，高表达SNHG7与患者生存时间较短明显相关（图1B）。细胞学实验发现，与人正常前列腺上皮细胞（RWPE）相比，前列腺癌细胞（PC-3、VCaP和DU145）中SNHG7明显高表达（图1C）。这些结果提示，SNHG7在前列腺癌的发生、发展中发挥重要的作用。

图1 SNHG7在前列腺癌中高表达并提示预后不良Fig.1 SNHG7 is highly expressed in prostate cancer and indicates a poor prognosis

2.2 SNHG7主要位于细胞质

鉴于SNHG7在肿瘤组织和细胞中高表达，为进一步了解其功能和机制，通过荧光原位杂交实验检测SNHG7的亚细胞分布情况。结果提示，SNHG7主要位于细胞质。见图2。

图2 SNHG7主要位于细胞质中 ×400Fig.2 SNHG7 is mainly located in the cytoplasm ×400

2.3 敲低SNHG7抑制了前列腺癌细胞的增殖和迁移能力

为了进一步分析SNHG7的功能，构建SNHG7敲低细胞系。通过PCR对敲低细胞系进行SNHG7检测（图3A），结果显示，成功构建了敲低细胞系。随后使用SNHG7敲低细胞系进行MTT检测，评估SNHG7对PC-3细胞增殖的影响，结果发现，其抑制了细胞增殖（图3B）。Transwell迁移实验也发现，其抑制了前列腺癌细胞迁移（图3C）。这些结果提示，SNHG7在前列腺癌细胞的增殖和迁移中发挥重要作用。

图3 敲低SNHG7可抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移Fig.3 SNHG7 knockdown inhibits prostate cancer cell proliferation and migration

2.4 SNHG7调控ROCK1的表达

为了分析SNHG7能否通过ROCK1调节前列腺癌细胞的恶性进展，采用PCR检测ROCK1的表达，结果发现，ROCK1在多种前列腺癌细胞中高表达（图4A）。而当敲低SNHG7后，ROCK1mRNA表达减少（图4B），蛋白表达减少（图4C）。这说明SNHG7的对前列腺癌细胞恶性能力的调控可能是ROCK1介导的。

图4 敲低SNHG7可抑制ROCK1的表达Fig.4 SNHG7 knockdown inhibited ROCK1 expression

2.5 SNHG7通过ROCK1调控前列腺癌细胞的增殖和迁移

进一步分析SNHG7与ROCK1及前列腺癌细胞增殖和迁移能力的关系，进行挽救实验。首先构建ROCK1过表达细胞系，通过PCR（图5A）和Western blotting（图5B）检测转染后ROCK1的表达，结果证实，ROCK1过表达细胞系成功构建。随后使用SNHG7敲低细胞系同时进行ROCK1敲低，结果发现，前列腺癌PC-3细胞的增殖（图5C）和迁移能力（图5D）恢复。以上结果表明，SNHG7通过ROCK1调控前列腺癌细胞的增殖和迁移。

图5 SNHG7通过ROCK1调控前列腺癌细胞的增殖和迁移Fig.5 SNHG7 regulates prostate cancer cell proliferation and migration through ROCK1

3 讨论

近几十年来，lncRNA在疾病特别是癌症中的重要作用越来越受到人们的关注。研究［12］已经发现，许多lncRNA作为癌基因或肿瘤抑制因子，可以调控前列腺癌的发生和转移，但不同lncRNA在不同肿瘤中的作用尚不明确。lncRNA SNHG7是近年发现的新型非编码RNA，多项研究［13］表明，lncRNA SNHG7在多种癌症中过表达，包括肺癌、乳腺癌、结直肠癌和膀胱癌，通过多种途径促进肿瘤的发生。最近有研究［14］报道了SNHG7加速前列腺癌的恶性进展，但SNHG7在其中的调节机制需要进一步探索。

本研究发现，与癌旁组织相比，lncRNA SNHG7在癌组织中明显上调，并且SNHG7高表达提示患者生存时间缩短，体外细胞实验同样证明其在多种肿瘤细胞系中高表达。这些结果提示，SNHG7在前列腺癌的发生、发展中可能起到重要作用。为了阐明SNHG7异常高表达的意义，本研究通过细胞增殖实验和Transwell实验检测细胞增殖和迁移能力，结果发现，SNHG7敲低后前列腺癌PC-3细胞的增殖和迁移能力都被抑制。近年发现ROCK1与多种肿瘤的生长和转移密切相关，包括骨肉瘤、胰腺癌甚至血液系统肿瘤。ROCK1功能多样化，广泛参与多种细胞过程，包括凋亡、侵袭、纤维化等［15］。然而，SNHG7与ROCK1之间的调控关系尚不清楚。为此，本研究构建了SNHG7敲低前列腺癌细胞系，通过共转染实验发现，敲低SNHG7后ROCK1的表达明显减少；并且通过MTT实验和Transwell实验发现，SNHG7敲低后细胞的增殖和迁移能力可被过表达ROCK1恢复。

综上所述，SNHG7对于前列腺癌生长、转移的调控是通过ROCK1介导的，以SNHG7或ROCK1为靶点的肿瘤治疗方式可能成为治疗前列腺癌的一种有效策略。