栽培草莓小孢子细胞学发育时期与花器形态的相关性

马红叶， 王爱华， 李荣飞， 杨仕品*， 黄 伟， 乔 荣， 钟霈霖

(1.贵州省园艺研究所， 贵州 贵阳 550006； 2.贵州省农业科学院 山茂园艺工程技术中心， 贵州 贵阳 550006)

0 引言

【研究意义】小孢子培养是指从花蕾中游离出小孢子后，经过诱导培养，改变其配子体发育途径为孢子体途径，通过胚状体或愈伤组织方式成长为完整植株的方法，是植物单倍体育种的重要技术手段[1]。培养出的单倍体植株再经过染色体加倍形成二倍体或多单倍体，可达到快速获得纯合子，暴露或消除遗传有害基因，简化遗传系统，提高育种效率的目的[2]。草莓为高度杂合多倍体植物(栽培种草莓多为8倍体)，传统育种手段很难在抗性等方面获得突破，利用小孢子培养诱导产生胚状体获得纯合基因型株系，对草莓育种及遗传分析具有重要意义[3]。【前人研究进展】小孢子培养成功与否受小孢子发育时期[1]、基因型[4]、植株生理状态[5]、预处理[6]、培养基[7]和培养条件[8]等因素影响，其中小孢子发育时期是决定小孢子能否诱导成功的关键[1]。过早，小孢子发育不成熟，对外界适应能力差，不易存活；过晚，小孢子发育途径不可逆转，脱分化失败，不能形成胚状体[9]。HAUSE等[1]研究发现，单核靠边期(单核晚期)是小孢子培养的最佳时期，此期的小孢子对激素刺激和培养条件最为敏感，是诱导小孢子由配子体途径向孢子体途径转变的最有效时期。杨延红等[10-11]认为，双核早期同样可成功诱导小孢子，不同植物之间略有差异。通过显微镜细胞学观察可确定小孢子的发育时期，但需检查每个花药，费时费力，并会对小孢子活力造成一定的损伤，增加培养过程中的污染率和死亡率[9]。小孢子发育具有不同步性，尤其是草莓，不同花序甚至同一花序的不同花蕾，小孢子发育状态都存在差异[12]，镜检每个花蕾的实际操作并不现实，探寻便捷确定小孢子发育时期的方法具有重要意义。已有研究发现，小白菜[10]、辣椒[13]、黄花菜[14]、甘蓝[15]、火龙果[16]和枣[17]等多种植物的小孢子发育时期与花蕾外部形态，如花蕾纵径和横径、花药长宽及花瓣长等密切相关，可用于判别小孢子的发育时期。【研究切入点】未见栽培草莓小孢子细胞学发育时期与花器形态相关性的研究报道，为此，选择章姬、红颜、黔莓1号和黔莓2号4个草莓品种，探究其小孢子6个发育时期花蕾、花瓣、花药外观形态及花蕾纵横径、主副萼长、花瓣长、花药长的变化，以判别其小孢子的发育时期。【拟解决的关键问题】探明栽培草莓小孢子具有胚发生能力时期的花器形态，为小孢子培养田间准确取样提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

章姬、红颜、黔莓1号和黔莓2号4个草莓品种均为栽培种，其花蕾均采自贵州省园艺研究所草莓科技示范园。

1.2 方法

试验于2019年10月至2020年3月在贵州省园艺研究所草莓科技示范园进行。试验以章姬、红颜、黔莓1号和黔莓2号4个草莓品种为试材，观察测定小孢子花粉母细胞时期、四分孢子时期、单核早期、单核中期、单核晚期(单核靠边期)和双核期6个发育时期花蕾、花瓣、花药外观形态及花蕾纵横径、主副萼长、花瓣长和花药长的变化。观察记录花蕾形态，花瓣颜色、透明度及弯曲程度，花药颜色；采用数显游标卡尺测量草莓花蕾纵径、横径、花萼长、花瓣长及花药长度。每个发育时期观察测量15个花蕾，3次重复。

1.3 数据处理

采用DPS 7.05处理数据，Excel 2010制图，Duncan法检验差异显著性(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同草莓品种小孢子各发育时期花蕾等的外观特征

从图1看出，章姬、红颜、黔莓1号和黔莓2号4个草莓品种随着小孢子的不断发育，其花蕾均表现为体积不断增大，逐渐饱满，外观颜色由黄绿色逐步变为绿色，茸毛变稀变短。花蕾主、副萼由花粉母细胞时期的包裹极紧闭逐步变为双核期副萼全部展开，主萼松动。从表1可知，黔莓1号小孢子细胞学发育时期与花蕾形态和花瓣的颜色、透明度、弯曲程度及花药颜色相关。花瓣透明度：从母细胞时期的高透明、绿黄色逐渐发育至双核期的不透明、白中带青色，且弯曲程度由低到高再逐渐降低。花药颜色：在6个不同发育时期颜色变化为绿黄色透明→淡黄绿色半透明→黄绿色不透明→浅黄色不透明→柠檬黄色不透明→黄色不透明。花药光泽度：从花粉母细胞时期的有光泽发育到单核早期及之后的无光泽，其他3个品种花药颜色与黔莓1号稍有差异，但不明显。4个草莓品种在单核晚期，花蕾形态均表现为花蕾膨大饱满，副萼开张，主萼闭合，看不到花瓣。

注：A，花粉母细胞时期；B，四分孢子时期；C，单核早期；D，单核中期；E，单核晚期；F，双核期。

表1 黔莓1号小孢子不同发育时期花蕾、花瓣和花药的外观特征

2.2 不同草莓品种小孢子各发育时期花蕾的形态特征

2.2.1 章姬 从图2看出，除主副萼比外，章姬小孢子细胞学不同发育时期花蕾的横径、纵径、主萼长、副萼长、花瓣长和花药长均随发育时期的推进而不断增大，且差异显著，可根据以上指标断定小孢子的发育时期。其中，单核晚期花朵的纵、横径分别为9.93 mm和7.39 mm；主萼、副萼增长量最大，至双核期分别增加10.57 mm和10.54 mm；主副萼比变化较小，不同时期为0.93～0.99，各发育时期间差异不显著；花瓣长增幅最大，双核期花瓣长度是花粉母细胞时期的12.8倍；花药长增长量最少，从花粉母细胞时期的0.73 mm增至单核晚期的1.62 mm。

注：不同小写字母表示不同发育阶段花蕾的纵径、横径、主萼长、副萼长、主副萼比、花瓣长和花药长差异显著(P<0.05)。下同。

2.2.2 红颜 从图3看出，除主副萼比外，红颜小孢子细胞学不同发育时期花蕾的横径、纵径、主萼长、副萼长、花瓣长和花药长均随发育时期的推进而不断增大，且差异显著，可根据以上指标断定小孢子的发育时期。其中，单核晚期时花朵的横径、纵径分别为9.71 mm和7.39 mm；主萼、副萼长随着小孢子的不断发育而逐渐增大，至双核期均增长10 mm以上；主副萼比变化也较小，不同时期为0.96～1.01，各发育时期间差异不显著；花瓣长增幅最大，双核期花瓣长是花粉母细胞时期的12.68倍；花药长由花粉母细胞时期的0.78 mm增至双核期的1.78 mm。

图3 红颜小孢子不同细胞学发育时期的花蕾特征

2.2.3 黔莓1号 从图4看出，除主副萼比外，黔莓1号小孢子细胞学不同发育时期花蕾的横径、纵径、主萼长、副萼长、花瓣长和花药长均随发育时期的推进而不断增大，且差异显著，可根据以上指标断定小孢子的发育时期。经过6个发育时期，不同时期主副萼比为0.91～1.01，各发育时期间差异不显著；增长量最大的是主萼和副萼长，双核期较花粉母细胞时期分别增加9.36 mm和10.86 mm，增速最大的是花瓣长，双核期是花粉母细胞时期的13.77倍；单核晚期花蕾纵径、横径、主萼长、副萼长、花瓣长和花药长分别为9.63 mm、6.54 mm、11.75 mm、12.36 mm、5.65 mm和1.38 mm。

图4 黔莓1号小孢子不同细胞学发育时期的花蕾特征

2.2.4 黔莓2号 从图5看出，除主副萼比外，黔莓2号小孢子细胞学不同发育时期花蕾的横径、纵径、主萼长、副萼长、花瓣长和花药长均随发育时期的推进而不断增大，且差异显著，可根据以上指标明确断定小孢子的发育时期。其中，单核晚期花蕾纵径和横径分别为9.47 mm和6.39 mm，主萼长、副萼长、花瓣长和花药长分别为11.84 mm、12.55 mm、5.43 mm和1.73 m，不同时期主副萼比为0.93～1.00。

图5 黔莓2号小孢子不同细胞学发育时期的花蕾特征

2.3 不同草莓品种单核晚期的花蕾特征

从表2可知，单核晚期章姬、红颜、黔莓1号和黔莓2号4个草莓品种花蕾的横径、纵径和主萼长等的变化。纵径：不同品种为9.47～9.93 mm，依次为章姬>红颜>黔莓1号>黔莓2号，各品种间差异不显著。横径：不同品种为6.39～7.39 mm，依次为章姬=红颜>黔莓1号>黔莓2号，章姬和红颜显著大于黔莓1号和黔莓2号，章姬与红颜间和黔莓1号与黔莓2号间差异不显著。主萼长：不同品种为10.65～11.85 mm，依次为章姬>黔莓2号>黔莓1号>红颜，章姬、黔莓2号和黔莓1号间差异不显著，均显著长于红颜。副萼长：不同品种为11.13～12.55 mm，依次为黔莓2号>黔莓1号>章姬>红颜，黔莓2号显著长于红颜，章姬、黔莓1号与红颜间和黔莓2号、黔莓1号与章姬间差异均不显著。花瓣长：不同品种为5.00～5.65 mm，依次为黔莓1号>黔莓2号>章姬>红颜，黔莓1号显著长于章姬和红颜，章姬、红颜与黔莓2号间和黔莓1号与黔莓2号间差异均不显著。花药长：不同品种为1.63～1.70 mm，依次为黔莓2号>红颜>章姬=黔莓1号。

表2 单核晚期4个草莓品种的花蕾特征

3 讨论

适宜小孢子发育时期的选择是成功培养小孢子的关键[18]。AIONESEI等[19]研究认为，单核晚期至双核早期的小孢子容易诱导出胚状体。不同植物间，适宜培养阶段略有不同。LI等[20]通过培养单核晚期的白菜小孢子，成功诱导出胚。李智军等[21]采用单核晚期芥蓝小孢子进行培养，成功获得150个小孢子再生植株。而TAKAHATA等[22]研究发现，甘蓝小孢子培养的最佳时期是单核靠边期至双核期。王萌[12]以东北草莓和绿色草莓2个野生草莓单核晚期小孢子为试材，成功诱导出1个球形胚，可暂将单核靠边期作为草莓小孢子的适宜培养期。

小孢子细胞学发育时期与花蕾形态关系密切，花蕾形态特征可作为小孢子适宜培养阶段的取材依据[23]。杨延红等[10]研究发现，小白菜小孢子单核晚期花蕾纵径为2.68～3.80 mm，花蕾横径1.91～2.19 mm，花瓣长2.70～3.22 mm，花萼长2.15～2.71 mm，花药长1.76～2.39 mm，可作为小孢子单核晚期的采样依据。张琨等[14]研究认为，黄花菜花蕾纵径和花药长度在小孢子发育的 4个时期均存在极显著差异，适宜作为判断黄花菜小孢子发育时期的形态指标。庞强强等[24]研究菜心小孢子发育时期与花器官形态的相关性时发现，单核靠边期的花器官外观特征表现为花蕾饱满，萼片绿色并包被着花冠，花瓣和花药均为浅黄色，花药略长于花瓣，可依据花器官形态特征判断菜心小孢子发育时期。研究结果表明，章姬、红颜、黔莓1号和黔莓2号4个草莓品种小孢子细胞学发育时期与花蕾形态存在相关性，除主副萼比外，各品种小孢子细胞学不同发育时期花蕾的横径、纵径、主萼长、副萼长、花瓣长和花药长均随发育时期的推进而不断增大，且差异显著，均可根据以上指标明确小孢子的发育时期。

小孢子单核晚期，4个草莓品种花蕾外观上均为花蕾膨大、饱满，副萼开张，主萼闭合，看不到花瓣，花药柠檬黄色，不透明；花蕾纵径、花蕾横径、主萼长、副萼长、花瓣长和花药长分别为9.47～9.93 mm、6.39～7.39 mm、10.65～11.85 mm、11.13～12.55 mm、5.00～5.65 mm和1.63～1.70 mm。其中，各品种间花蕾纵径和花药长差异不显著，适宜作为不同草莓材料取样时期的鉴定指标；其余指标各品种间差异显著或不显著，其变化特征可能与品种本身的特性有关。因此，在花蕾横径、主萼长、副萼长和花瓣长上很难找到用于选取适宜发育时期花蕾的统一标准。田间采样时可将花蕾膨大、饱满，副萼开张，主萼闭合，看不到花瓣，花药柠檬黄色和花蕾纵径 9.47～9.93 mm，花药长1.63～1.70 mm作为判断小孢子单核晚期发育阶段的指标，省去镜检的繁琐步骤，做到精准取样，提高小孢子培养效率。

4 结论

章姬、红颜、黔莓1号和黔莓2号4个草莓品种小孢子发育阶段与其花器官性状密切相关，其花蕾纵径、横径、主萼长、副萼长、花瓣长、花药长均随小孢子发育不断显著增大，可作为各品种细胞发育时期的判断标准。其中单核晚期的判断标准为花蕾膨大、饱满，副萼开张，主萼闭合，看不到花瓣，花药柠檬黄色，花蕾纵径和花药长分别为9.47～9.93 mm和1.63～1.70 mm。