红肉冰糖橙的品质与遗传鉴定

2022-05-27戴素明邓子牛李大志

贵州农业科学 2022年5期

周嘉，李娜，戴素明，邓子牛，李大志*

(1.湖南农业大学园艺学院，湖南长沙 410128； 2.贵州省果树科学研究所，贵州贵阳 550006)

0 引言

【研究意义】湖南柑橘栽培历史悠久，目前种植面积居全国第二，是国内重要的甜橙产区之一[1]。冰糖橙(CitrussinesisOsback)又名冰糖柑，是20世纪70年代选育的优良低酸甜橙品种[2]，具有低酸、脆嫩化渣等优点，与国内外其他低酸类甜橙品种有明显区别，是湖南重点推广的优良甜橙品种[3]。冰糖橙经过多年发展，深受广大消费者喜爱，已成为湖南特色主栽甜橙品种，在湖南洪江、麻阳、永兴以及云南新平有大面积推广种植[4]。开展红肉冰糖橙育种工作可进一步丰富冰糖橙产区品种资源，为冰糖橙产业发展提供更多的品种选择，对其产业持续健康发展具有重要意义。【前人研究进展】近年来，全球柑橘育种成果丰硕，通过芽变选种、资源发掘和杂交选育等方式已培育出100余个柑橘品种，特别是鲜食柑橘品种[5-6]。柑橘品种选育多依赖于芽变选种，尤其是性器官败育的脐橙和温州蜜柑品种，红肉脐橙是从华盛顿脐橙中发现的果肉红色芽变[7]，橘湘早[8]、由良[9]和宫川等均是从温州蜜柑中选育出来的不同熟期芽变品种。资源调查发掘野生和地方良种也是柑橘育种的有效途径，资阳香橙[10]即是从地方资源中选育出来的优良柑橘砧木，马家柚、琯溪蜜柚和安江香柚等均是从地方良种中发掘选育而成。受珠心胚干扰，柑橘杂交品种数量相对较少，爱媛28、沃柑、不知火和W莫科特等是国外选育的优良杂柑品种，中国选育的金秋砂糖橘、大雅柑市场反映良好。其中，湖南通过芽变选种等手段选育出锦玉[11]、锦红[12]、锦秀[13]和黔阳冰糖脐橙[14]等冰糖橙品种，与普通冰糖橙相比果实品质均有一定提升，对湖南柑橘品种结构调整具有重要作用，现已得到大力推广，获得较好的经济效益[15]。【研究切入点】红肉柑橘因其色泽鲜艳而具有特殊的市场潜力，但目前还鲜见红肉类型冰糖橙品质分析与遗传鉴定的研究报道。从郴州某冰糖橙果园中筛选出冰糖橙红肉芽变，经初步观察发现，该变异株系红肉性状稳定，并对其果实品质进行分析与汁胞红色色素检测以及遗传变异分子标记分析。【拟解决的关键问题】探明红肉冰糖橙的品质及遗传变异状况，以期为红肉冰糖橙芽变品种的选育及其开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 果实果实均为红肉冰糖橙、普通冰糖橙和红肉脐橙成熟鲜果，均于2018年11月24日采自湖南郴州，采集样品时选树龄、树势相对一致的成年结果树，每株树随机采摘果实25个，采样树的砧木均为枳〔Poncirustrifoliata(L.) Raf〕；果实用于品质及汁胞红色色素分析。

1.1.2 样品叶片试验样品红肉冰糖橙为芽变甜橙，对照样品普通冰糖橙、橘湘珑冰糖橙、锦玉冰糖橙和红肉脐橙均为甜橙；样品叶片用于遗传鉴定，由国家柑橘改良中心长沙分中心实验室完成。

1.1.3 仪器 U-3900紫外可见分光光度计，日立(中国)有限公司；Infinite 200 PRO NanoQuant酶标仪，瑞士帝肯(上海)贸易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 指标测定

1) 果实品质。果实横、纵径及皮厚采用游标卡尺测量；果实重量采用电子天平称量；果汁可溶性固形物含量采用手持测糖仪测定；可滴定酸含量用酸碱滴定法测定；维生素C含量参照文献[16]的方法采用抗坏血酸标定法测定。

可食率=(果实质量-果皮质量-种子质量)/果实质量×100%

出汁率=(果汁质量/果实质量)×100%

2) 汁胞红色色素含量。β-胡萝卜素和番茄红素含量，参照文献[17]的方法采用HPLC法测定。将柑橘汁胞冻干研磨成粉末，称取0.2 g样品于15 mL离心管中，加入6 mL丙酮；用锡箔纸将离心管包住，封紧瓶盖，冰浴超声2 h，4℃、1 000 r/min离心10 min；取5 mL上清常温浓缩，再加入500 μL丙酮复溶，4℃、1 200 r/min离心10 min；取20 μL上清HPLC液相分析。类胡萝卜素含量，参照文献[18]的方法采用分光光度计法测定。将甜橙汁胞冻干，称取0.03 g样品，加入3 mL 80%丙酮研磨成匀浆，将研磨液转移到玻璃试管中；用2 mL 80%丙酮冲洗研钵，并将冲洗液转移到玻璃试管中，重复冲洗3次，依次将冲洗液转移到玻璃试管；加塞并用封口膜封紧，常温下放暗处浸提48 h，至样品褪去颜色发白为止；用80%丙酮定容至25 mL，摇匀，此液即为类胡萝卜素提取液。分别测定类胡萝卜素提取液与80%丙酮在波长663 nm、645 nm和470 nm下的吸光度，计算类胡萝卜素含量。

1.2.2 遗传变异分子标记分析采用改良CTAB法提取各甜橙的叶片DNA，并用酶标仪检测其浓度和纯度。从实验室柑橘分子数据库中筛选遗传变异分子标记鉴定位点，利用Primer 5设计引物(正向引物序列为GCCACAGAGCAGACAGGAA，反向引物序列为CACGGTGTCGAGGAGACTTT)，对红肉冰糖橙进行PCR扩增，PCR产物在2%琼脂糖凝胶上120 V电泳40 min，结束后置于凝胶成像系统观察并拍照。

1.3 数据处理

采用Excel 2010和SPSS 17.0 对数据进行统计与分析。

2 结果与分析

2.1 红肉冰糖橙的品质

2.1.1 果实品质从表1可知，红肉冰糖橙、红肉脐橙和普通冰糖橙横径、纵径、单果重、皮厚和可食率的差异。横径和纵径分别为65.66～79.18 mm和63.58～77.84 mm，均为红肉脐橙>普通冰糖橙>红肉冰糖橙；单果重为143.86～252.00 g, 依次为红肉脐橙>普通冰糖橙>红肉冰糖橙；皮厚为3.28～3.96 mm，依次为普通冰糖橙>红肉脐橙>红肉冰糖橙；可食率为62.81%～65.90%，依次为红肉冰糖橙>红肉脐橙>普通冰糖橙；出汁率为41.95%～53.97%，依次为红肉脐橙>普通冰糖橙>红肉冰糖橙；可溶性固形物为11.33%～12.53%，依次为普通冰糖橙>红肉冰糖橙>红肉脐橙；可滴定酸为0.20%～0.78%，依次为红肉脐橙>普通冰糖橙>红肉冰糖橙；固酸比为14.53～58.30，依次为红肉冰糖橙>普通冰糖橙>红肉脐橙；维生素C为58.36～63.39 mg/100mL，依次为红肉脐橙>普通冰糖橙>红肉冰糖橙。从图1看出，红肉冰糖橙与普通冰糖橙相比，果肉为红色，果实相对较小，出汁率较低；与红肉脐橙相比，红肉冰糖橙在果梗及果皮白皮层处也有红色着色。

表1 不同甜橙品种的果实品质

图1 不同甜橙品种的果实切面示意

2.1.2 汁胞红色色素含量从表2看出，红肉冰糖橙、红肉脐橙和普通冰糖橙β-胡萝卜素、番茄红素和类胡萝卜素含量的变化。β-胡萝卜素为3.34～70.98 μg/g，依次为红肉脐橙>红肉冰糖橙>普通冰糖橙，各品种间差异显著；番茄红素为0.74～3.19 μg/g，依次为红肉冰糖橙>红肉脐橙>普通冰糖橙，各品种间差异显著；类胡萝卜素为69.72～212.87 μg/g，依次为红肉脐橙>红肉冰糖橙>普通冰糖橙，各品种间差异显著。

表2 不同甜橙品种汁胞红色色素的含量

2.2 红肉冰糖橙的遗传鉴定

从图2看出，引物合成后经PCR扩增结果显示，红肉冰糖橙在100～250 bp出现特异性条带，说明其与普通冰糖橙、橘湘珑冰糖橙、锦玉冰糖橙和红肉脐橙等对照在DNA水平存在差异，具有成为新品种的遗传基础。

注：2K为Trans 2K DNA Maker；1为红肉冰糖橙，2～5分别为冰糖橙、橘湘珑冰糖橙、锦玉冰糖橙和红肉脐橙(对照)。

3 讨论

目前，国内大规模种植的红肉类型甜橙主要是红肉脐橙和血橙，2个品种果实酸度较高，果实成熟期均在12月以后，选育红肉冰糖橙可让红肉类型甜橙提早上市，抢占市场[5-6]。湖南通过芽变选种等手段选育出锦玉和锦红等[11-14]冰糖橙品种，与普通冰糖橙相比果实品质有一定提升，对湖南柑橘品种结构调整具有重要作用[15]。红肉冰糖橙果肉颜色与红肉脐橙接近，其主要着色色素也是番茄红素，初步推测红肉冰糖橙果肉着色机理可能与红肉脐橙相似[19]。研究结果表明，在红肉冰糖橙、红肉脐橙和普通冰糖橙中，果实横径和纵径分别为65.66～79.18 mm和63.58～77.84 mm，均为红肉脐橙>普通冰糖橙>红肉冰糖橙；皮厚为3.28～3.96 mm，依次为普通冰糖橙>红肉脐橙>红肉冰糖橙；可食率为62.81%～65.90%，依次为红肉冰糖橙>红肉脐橙>普通冰糖橙；可溶性固形物为11.33%～12.53%，依次为普通冰糖橙>红肉冰糖橙>红肉脐橙；维生素C为58.36～63.39 mg/100mL，依次为红肉脐橙>普通冰糖橙>红肉冰糖橙；可滴定酸为0.20%～0.78%，依次为红肉脐橙>普通冰糖橙>红肉冰糖橙。β-胡萝卜素为3.34～70.98 μg/g，依次为红肉脐橙>红肉冰糖橙>普通冰糖橙；番茄红素为0.74～3.19 μg/g，依次为红肉冰糖橙>红肉脐橙>普通冰糖橙；类胡萝卜素为69.72～212.87 μg/g，依次为红肉脐橙>红肉冰糖橙>普通冰糖橙；各品种间3种色素含量均差异显著。引物合成后经PCR扩增，红肉冰糖橙在100～250 bp出现特异性条带，与普通冰糖橙在DNA水平存在差异。普通冰糖橙成熟期为11月下旬或12月上旬，红肉冰糖橙成熟期为11月上中旬，略有提前，可提早采收期，错开普通冰糖橙上市高峰期，有利于提高其经济效益。