HPLC法测定ALK抑制剂布格替尼的含量*

俞建君，郝卫强

(常州工程职业技术学院，江苏 常州 213003)

布格替尼的化学名为5-氯-N2-[4-[(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]-2-甲氧基苯基]-N4-[2-(二甲基亚膦酰)苯基]-2,4-嘧啶二胺(I)，为酪氨酸激酶抑制药，美国FDA 于2017年4月28日批准阿瑞雅德(Ariad)公司的布格替尼片剂上市，用于对克唑替尼不耐受或用药后疾病进展的患者治疗间变性淋巴瘤激酶(ALK)阳性的转移性非小细胞肺癌。本文拟采用高效液相色谱法测定布格替尼原料药的含量。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津，包括 DGU-20A 在线脱气机、LC-20AD Pump 四元泵、CTO-20AC 柱温箱、SPD-20A紫外检测器、岛津LabSolutions工作站及 20 μL 手动进样系统)；Venusil C18(5 μm，4.6200 mm)色谱柱(Agela Technologies Inc)；Millipore 纯净水发生器。

色谱纯甲醇(布格替尼标准品)，北京中科质检生物技术有限公司，布格替尼样品，自制。

1.2 色谱条件

流动相为磷酸二氢钾(0.02 mol/L， pH由磷酸调节至4.50):甲醇=40:60，流速为1.0 mL/min，检测波长为285 nm，柱温为25 ℃，进样体积为20 μL。

1.3 对照品溶液和样品溶液

精确称取0.10 g的布格替尼标准品至100 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度。合成的样品以同法配制成溶液。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

将布格替尼标准品溶于甲醇中，以甲醇为参比，在200～350 nm范围内进行扫描，发现其在285 nm处有最大吸收，故选择285 nm为布格替尼的检测波长。

2.2 缓冲盐pH的优化

考察缓冲盐pH 2.5～4.5 之间，样品中布格替尼主峰与前后杂质峰的分离情况。随着 pH值提高，主峰的峰形得到改善，主峰及与前面杂质峰的分离度提高。当缓冲盐pH值为4.5时，分离效果最佳(见图1)。图2为布格替尼对照品谱图。

图1 布格替尼专属性色谱图Fig.1 Specificity chromatograms of Brigatinib (Peak identifications: 1-impurity; 2-Brigatinib)

图2 布格替尼对照品色谱图Fig.2 Chromatograms of Brigatinib reference standards

2.3 方法评价

2.3.1 线性范围

从布格替尼对照品溶液中，分别移取1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、8.0 mL、10.0 mL至50 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容。在本文实验条件下进样分析，以峰面积对浓度作图，结果表明0.020～0.200 mg/mL范围内，相关系数为0.9999，线性关系良好。

2.3.2 定量限和检测限

将标准溶液多次稀释后作为定量限测定溶液，以10倍信噪比(S/N=10) 的结果作为定量限。得定量限为0.4520 μg/mL。

将标准溶液多次稀释后作为检测限测定溶液，以3倍信噪比(S/N=3) 的结果作为检出限。得检出限为0.1479 μg/mL。

2.3.3 精密度和回收率

取标准系列中间浓度溶液，连续进样6针，以峰面积的重复性验证方法的精密度，计算其RSD为0.60%。向空白溶液中分别加入低、中、高3个水平的标准溶液进行加标回收率的测定。结果(见表1)表明，布格替尼加标平均回收率为98.93%。

2.3.4 稳定性试验

把配制好的样品溶液放置24 h后进样分析，布格替尼含量的回收率100.4%，说明样品溶液的稳定性良好。峰面积重现性

2.3.5 耐用性试验

配制一定浓度的布格替尼溶液，分别改变色谱条件中的pH、流速、柱温和流动相比例，观察布格替尼主峰与前一杂质峰的分离度和主含量的回收率变化。结果表明，色谱条件的微小变化，对布格替尼主峰的分离度和回收率影响不大，见表2。

表1 布格替尼回收率试验

表2 方法耐用性试验数据

3 结 论

本文叙述了用高效液相色谱法测定ALK 抑制剂布格替尼含量的方法。本方法建立了布格替尼的色谱最佳分离条件，布格替尼含量测定的线性关系是良好的。精密度和准确度较高，样品的预处理并不烦琐。因此，本方法可以用来对ALK 抑制剂布格替尼含量进行快速而准确的测定。