多重PCR技术在调查分析水族馆海兽饲养环境中致病菌的应用

熊 冉，萧 晟，陈文华

(1.芜湖职业技术学院，安徽芜湖 241003；2.应节(南京)智能科技有限公司，江苏南京 210000)

0 引言

水族馆行业是随着社会发展进步于近些年新兴的科普旅游行业，水族馆作为集旅游、科普、展示和养殖于一体的经营场所，人员复杂、动物聚集且流动频繁等因素导致各类病原体很容易在不同种类的动物和环境之间相互传播，从而致使观赏动物发生显性或隐性感染.因此，利用准确、有效、快捷的方法调查分析其生活区域存在的致病菌十分必要，同时也可给予饲养繁育及临床诊疗明确的指引[1].近年来，有学者对野生动物各类疫病都展开了调查研究，2019年，贵州省某野生动物园2只赤猴突然发病死亡，经检验确诊本次疾病为魏氏梭菌感染[2]；2021年，秦皇岛地区从水貂分离到的沙门氏菌均具有一定的致病力和多重耐药性[3]；2016年孙泉云等利用PCR技术对上海地区规模猪场环境中的致病菌进行检测[4]；2020年，沈燕等利用多重PCR技术对水环境中致病菌分子进行生物学检测[1].

本实验以某海族馆海兽饲养环境为对象，先后两次(隔半年)采用多重PCR技术快速检测海兽饲养、表演环境中各类微生物的种类及数量，进而分析确定其中对海兽造成疾病危害的致病菌种类，更有利于园区对海洋哺乳动物健康的保障，为疾病防控工作提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 检测样品

样品主要来自海兽饲养区、饲养员办公区以及海兽表演区，分别对不同区域进行环境致病菌污染状况调查以及采样工作，水族馆各区域内随机采样，前后两次采集棉拭子样本共28份，具体分布如下(表1).

1.2 仪器设备

SW-CJ-2FD超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；H1650R离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；NP968-S全自动核酸提取仪，西安天隆科技有限公司；Gentier 32R全自动PCR分析系统，西安天隆科技有限公司；BIOMRIEUX细菌鉴定仪，杭州怡蓝生物技术有限公司.

1.3 检测方法

样本棉拭子经处理后接种培养基，增殖培养，采用常规微生物检测方法[4-5]，通过分离纯化，染色镜检、生化实验等方式，结合细菌鉴定仪鉴别革兰氏阴性菌、阳性菌或腐败发酵菌等，将纯化后的待检菌液经热处理后作为模板，使用通用引物，利用多重PCR技术扩增靶序列，经电泳初步鉴定，最后送至金斯瑞生物公司使用16S rRNA方式测序[6]，经GeneBank数据库Blast序列比对最终得出结果.

1.4 数据统计

前后两次对此海兽饲养环境不同区域进行采样，第一次共采集棉拭子样本11份，主要针对饵料区、办公区和观众看台区；第二次共采集棉拭子样本17份，主要分布于海兽生活区(包括海水)、表演区后场至表演台，检测结果以样品中各类微生物的检出率进行统计[4].

2 结果与分析

2.1 两次采样检测出的微生物种类及数量

根据前后两次采样检测出的结果(表2)，两次检测的样本分别检测出13种微生物，其中均有恶臭假单胞菌、约氏不动杆菌、溶血不动杆菌和深海微小杆菌，其余小部分细菌由于阳性检测率较低，不作为参考依据.在第一次收集到的11份棉拭子样本中，恶臭假单胞菌和约氏不动杆菌数量均达19%，其次是绿色气球菌和双氮氧弧菌，各占9%，其余9种细菌分别占总数5%及以下；第二次收集到的17份棉拭子样本中，嗜冷杆菌和恶臭假单胞菌数量各占18%，约氏不动杆菌、深海微小杆菌、荧光假单胞菌和海洋假单胞菌占9%，其余7种细菌占4%.这些细菌分布在海兽饲养管各个区域，主要侵害水生动物，在环境条件适宜时开始增殖分化，吸附于组织表面，致病性增强.

2.2 两次检测出的微生物分布区域及致病性

根据第一次样本检测数据分析(表3)，海洋馆中存在较多的细菌为约氏不动杆菌和恶臭假单胞菌，其中约氏不动杆菌属于腐败菌，常见于水体和土壤中，易在潮湿环境中生存，粘附力极强；恶臭假单胞菌是水生动物常见的致病菌，主要分布在饵料间、海狮笼地面、两侧看台楼梯，均与海兽直接接触，应引起重视.

结果显示，在本次分离到的13种细菌中，致病菌包括琼氏不动杆菌、恶臭假单胞菌、河流漫游球菌、绿色气球菌和溶血不动杆菌，这些细菌多存在于水生动物生存环境中，主要分布在海狮笼区域，两侧看台楼梯(尤其是看台西楼梯)以及舞台区，饲养员每天接触动物，或称为携带者，有传播到其他区域的潜在风险.

根据第二次样本检测数据分析(表4)，本次分离出来的菌主要有恶臭假单胞菌和嗜冷杆菌，嗜冷杆菌主要为环境菌，少数种类有致病性，分布区域主要是人员通道；恶臭假单胞菌为致病菌，主要分布在东池台面及栅栏、饵料间、西栅栏及台面、表演后场楼梯东，与第一次分离结果相似.分离到的13种细菌中致病菌有溶血不动杆菌、恶臭假单胞菌、豚鼠气单胞菌、荧光假单胞菌、粪嗜冷杆菌，致病菌主要分布在卫生间走道、池台面及栅栏、表演后场楼梯，饲养与驯导人员应注意及时消毒，避免携带感染.

3 讨论

3.1 饲养环境定期消毒，保障动物健康

根据该水族馆海兽饲养环境中致病菌的检测结果和分布情况，说明目前该海兽饲养区域、表演区域及饲养员办公区域恶臭假单胞菌、溶血不动杆菌等致病菌污染的普遍性.这些致病菌在海兽遭遇不良应激或者抵抗力下降时，很容易感染动物引发临床症状.一般针对饵料台面采用碘酸混合溶液(百胜)或癸甲溴铵溶液(百毒杀)定期消毒；海狮笼以及场地一般使用次氯酸钠溶液等常规消毒剂；水体带动物一般使用黄粉，严重时可用高锰酸钾溶液；饲养员及工作人员接触动物前后应做好全面消毒工作，及时清理动物粪便等其他废弃物.

3.2 微生物快速检测应定期化、常规化

水族馆作为经营场所，人员及环境较为复杂，因此，微生物快速检测应纳入场馆常规工作计划，该方法快速有效，针对场馆内各类水生、陆生动物生活环境中致病微生物监控提供重要依据.根据检测结果，饲养员在日常动物管理过程中可避免交叉感染、重复感染，工作人员在清洁过程中更有针对性，对于各类疾病的防控起到重要作用.当地动物疫控相关部门也应加强监测和巡查，避免发生严重疾病传播.