黄芩乙醇提取物对猕猴桃溃疡病致病菌抑菌机理研究
2022-05-26裴沪荣卢明秀龙力龙章富
裴沪荣 卢明秀 龙力 龙章富
摘要：【目的】探究黃芩乙醇提取物（Ethanol extract of Scutellaria baicalensis，ESB）对猕猴桃溃疡病病原菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidiae， Psa）的抑菌机理，为开发新型植物源杀菌剂提供理论依据。【方法】以Psa为研究对象，采用琼脂打孔法评估Psa对ESB的敏感性;通过梯度稀释法确定液体培养时ESB对Psa的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。探究1/4MIC、1/2MIC、3/4MIC和MIC下ESB对Psa的作用效果。通过菌液光密度绘制Psa生长曲线、电导率仪测定培养液上清电导率、考马斯亮蓝法检测胞外可溶性蛋白含量、碱性磷酸酶（AKP）试剂盒检测AKP活性、硫酸亚铁法测定菌体对磷的代谢、氧化还原反应测定呼吸链脱氢酶活性、0.3%固体培养基检测Psa泳动能力;扫描电镜和透射电镜观察Psa在MIC处理下的形态变化。【结果】5种ESB浓度作用下的抑菌圈直径均在16.00 mm以上，MIC和MBC均为2.4 mg/mL。ESB能抑制Psa生长，破坏细胞膜和细胞壁，造成电解质、蛋白质外泄，干扰菌体正常的物质和能量代谢;ESB可显著抑制Psa泳动能力，阻碍细胞的迁移。扫描电镜和透射电镜观察发现，ESB作用后的Psa菌体形态出现缩短、凹陷、畸形、破裂，细胞质外泄，菌体大量裂解等现象。【结论】ESB可破坏Psa的细胞结构，干扰物质和能量代谢，抑制菌体生长，具有开发成植物源杀菌剂的潜力。
关键词： 黄芩;乙醇提取物;猕猴桃溃疡病致病菌;抑菌机理
中图分类号： S436.634.12 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2022）02-0477-09
Primary antibacterial mechanism of ethanol extract of Scutellaria baicalensis against the pathogens of kiwifruit canker
PEI Hu-rong， LU Ming-xiu， LONG Li， LONG Zhang-fu
（College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610064， China）
Abstract：【Objective】To explore the antibacterial mechanism of ethanol extract of Scutellaria baicalensis （ESB） on the pathogen of kiwifruit canker against Pseudomonas syringae pv. actinidiae （Psa） and to provide a theoretical foundation for the development of new plant-derived fungicides. 【Method】The sensitivity of Psa to ESB was evaluated by the agar punch method. The minimum inhibitory concentration （MIC） and the minimum bactericidal concentration （MBC）were determined by gradient dilution method in liquid medium. The effect of ESB on Psa at 1/4 MIC， 1/2 MIC， 3/4 MIC and MIC was determined. Growth curre was drawn by monitored optical density of the bacterial cullture. Electric conductivity of culture supernatant was measured by conductivity meter. Extracellular soluble protein content was determined by the Coomassie brilliant blue method. Alkaline phosphatase （AKP） activity was measured with an AKP kit.Phosphorus metabolism was detected by the ferrous sulfate method. Respiratory chain dehydrogenase activity was detected by oxidation-reduction reaction. Swimming motility ability was detected in 0.3% solid medium. Scanning electron microscope （SEM） and transmission electron microscope （TEM） were performed to observe Psa morphology at MIC. 【Result】The inhibition zone diameter of ESB against Psa was above 16.00 mm. The MIC and MBC were 2.4 mg/mL. ESB inhibited the growth of Psa， damaged the cell membrane and cell wall which caused the leakage of proteins and electrolytes. Moreover， the ESB interfered with normal material and energy metabolism. ESB can significantly resist the swimming of Psa and hinder cell migration. ESB can significantly resist the swimming of Psa and hinder cell migration. Scanning electron microscopy and transmission electron microscopy showed that morphology of Psa was shortened， depressed， deformed and lysed with ESB， which caused the leak of cytoplasm and bacterial lysis. 【Conclusion】ESB inhibit the normal growth of Psa by destroying the structure of Psa and interfering with substances and energy metabolism. ESB has the potential to be developed as a plant-derived fungicide.
Key words： Scutellaria baicalensis; ethanol extract; Pseudomonas syringae pv. actinidiae; antibacterial mechanism
Foundation items： The National Key Research and Development Program of China（2017YFD0201105）; Sichuan University-Luzhou Strategic Cooperation Project （2020CDLZ-22）
0 引言
【研究意义】自1984年首次报道猕猴桃溃疡病至今，猕猴桃溃疡病已蔓延至全球，给全球猕猴桃产业造成巨大经济损失（Wicaksono et al.，2018）。我国猕猴桃种植面积广阔，四川等主要猕猴桃种植区已受到该细菌性病害影响（王丽等，2017）。如何有效、安全地控制猕猴桃溃疡病已受到种植者的广泛关注。目前控制猕猴桃溃疡病的方法主要是施用链霉素和含铜化合物，该方法易导致耐药菌产生、环境污染和药物残留等问题（Cameron and Sarojini，2014）。植物中含有丰富的天然活性成分，其毒副作用小，不易产生抗药性，市场前景广阔（郜玉钢等，2019;祁高展等，2020;Simonetti et al.，2020）。因此，研发新型、高效、安全的猕猴桃溃疡病杀菌剂对猕猴桃的安全生产具有重要意义。【前人研究进展】丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidiae，Psa）是一种好氧型革兰氏阴性植物致病细菌，是造成猕猴桃溃疡病的主要原因（Ferrante and Scortichini，2015;Wicaksono et al.，2018;He et al.，2019;Sawada and Fujikawa，2019）。Young（2012）提出采用育种的方法选育抗Psa猕猴桃植株。Monchiero等（2015）研究发现在猕猴桃生长阶段使用含铜化合物能有效预防猕猴桃溃疡病。Scortichini（2018）也发现氯氧化铜和硫酸铜能有效控制Psa。Brunetti等（2020）通过体外试验和植物试验发现三乙膦酸铝和阿拉酸式-S-甲基2种农药能有效抑制Psa生长，降低猕猴桃溃疡病的感染率。抗病植株选育费时费力，铜类化合物和农药的大量使用会导致环境污染和药物残留（Colombi et al.，2017）。有关学者正在努力寻找更有效、安全的方法控制猕猴桃溃疡病，如内生细菌（Wicaksono et al.，2018）、天然产物（Lovato et al.，2019）和特异性噬菌体（Slater and Frankel，2020）筛选等。黄芩（Scutellaria baicalensis）作为我国传统中药，其应用广泛。赵宝颖（2012）采用柱层析等方法获得黄芩乙醇提取物中的21种单一化合物，抗菌试验发现提取物对水稻纹枯病菌等植物病原菌有明显的抑制作用。张伟等（2018）研究证实猪链球菌感染的细胞在黄芩提取物作用下存活率极大提升。Shen等（2018）采用高效液相色谱法获得黄芩的主要成分黄酮类化合物及其衍生物，包括黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素等。Trinh等（2018）、Da等（2019）发现黄芩中的物质能有效抑制黑曲霉、米曲霉、烟曲霉、白色念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌等病原真菌。郭泽宇（2020）、蒋长军等（2021）发现黄芩苷能抑制嗜水气单胞菌和大肠杆菌生长及生物膜的形成。姚雪等（2020）采用90%乙醇回流法提取黄芩中的有效成分，分离鉴定出14种黄酮类化合物。Do等（2021）发现汉黄芩素在体外能显著抑制米曲霉生长，500 μg/mL汉黄芩素对稻瘟病菌的抑制率高达63%;黄芩素对青枯菌在内的3种植物致病菌的最低抑菌浓度（MIC）为19 μg/mL。【本研究切入点】Psa是造成猕猴桃溃疡病的主要原因，猕猴桃感染Psa后致死率高，尚无有效的控制方法，迫切需要开发新型药物控制Psa。目前，黄芩对Psa抑制作用的相关研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】测定黄芩乙醇提取物（Ethanol extract of S. baicalensis，ESB）对Psa生长、细胞壁、细胞膜、物质代谢、能量代谢、泳动能力及细胞形态的影响，揭示ESB抗菌机理，为黄芩活性物质的开发利用和新型植物源杀菌剂的研发提供科学依据。
1 材料與方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 供试植物材料及预处理 黄芩购自成都武侯区中药店，采用冷浸法制备黄芩乙醇粗提物（Lin et al.，2016）。黄芩粉碎过40目筛，按照溶剂∶干粉=10∶1（v/m）的比例加入无水乙醇室温浸泡。收集滤液，使用旋转蒸发仪在45 ℃水浴下进行浓缩，获得浸膏，4 ℃保存待用。
1. 1. 2 供试菌株 Psa由四川大学生物资源与生态环境教育部重点实验室保藏，于28 ℃下180 r/min摇床中培养。采用特异性引物Psa_A1 F2和Psa_A1 R1对致病菌进行鉴定（Andersen et al.，2018）。
1. 1. 3 培养基 KB培养基（固体培养基添加15.0 g琼脂）：蛋白胨20.0 g，甘油10 mL，K2HPO41.5 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，去离子水1000 mL，自然pH，121 ℃高压蒸汽灭菌30 min。
1. 1. 4 主要试剂与仪器设备 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（生工生物工程（上海）股份有限公司）;碱性磷酸酶（AKP）试剂盒（南京建成生物工程研究所）;其余试剂均为国产分析纯。HH-S4数显恒温水浴锅（济南来宝医疗器械有限公司）;R-1001N旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）;中药高速粉碎机（浙江兰溪市伟能达电器有限公司）;AHC电子天平（上海友声衡器有限公司）;LD-B50L型高压灭菌锅（合肥华泰医疗设备有限公司）;SW-CJ-2D超净工作台（上海苏净实业有限公司）;RGX型人工气候培养箱（北京中兴伟业仪器有限公司）;Thermo Multiskan连续波长酶标仪（美国赛默飞世尔科技公司）;UV-5500紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司）;DDS-11A电导仪（上海佑科仪器仪表有限公司）。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 ESB抑菌活性测定 用二甲基亚砜（DMSO）溶解黄芩粗提物配制100 mg/mL的ESB母液，过滤除菌备用。Psa活化并培养至对数生长期，用生理盐水调整菌体浓度为107CFU/mL。琼脂打孔法测定50.000、25.000、12.500、6.250和3.125 mg/mL（DMSO稀釋）ESB的抑菌效果，以等量DMSO作对照。28 ℃培养24 h，十字交叉法测量抑菌圈大小。
1. 2. 2 最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）测定 参考Yang等（2005）采用梯度稀释法测定ESB的MIC和MBC。取对数生长期的Psa菌液，液体KB培养基调整菌体浓度为107 CFU/mL，加入ESB使药物终浓度分别为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6和4.0 mg/mL，另设对应体积的加药培养基（不加Psa）作为空白对照，DMSO为阴性对照。28 ℃培养24 h，使用酶标仪测定600 nm波长处的吸光值。试验组与空白组吸光度无明显差异的浓度定义为MIC（Lovato et al.，2019）。吸取100 μL上述培养液涂布，28 ℃培养48 h，观察菌落形成情况。将不长菌落的平板所对应的浓度定义为MBC（Lovato et al.，2019）。
1. 2. 3 细菌抑菌生长曲线测定 将Psa培养至对数生长期，液体KB培养基调整菌体浓度为107 CFU/mL。向含菌KB培养基中加入ESB使其终浓度分别为1/4MIC、1/2MIC、3/4MIC和MIC，DMSO为空白对照，28 ℃下180 r/min培养。每隔2 h时取样，测定600 nm波长处的吸光值。
1. 2. 4 电导率测定 菌体处理方法同1.2.3。分别在培养0、2、4、6、8、10和12 h时取样，4000 r/min离心5 min，弃沉淀，测定上清液电导率。
1. 2. 5 蛋白质泄漏测定 菌体处理方法同1.2.3。分别在培养0、3、6、9、12和15 h时取样，4000 r/min离心5 min，取上清，采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量。
1. 2. 6 碱性磷酸酶（AKP）测定 菌体处理方法同1.2.3。分别在培养0、1、2、4、6、8和10 h取样，4 ℃下4000 r/min离心5 min，取上清，按照碱性磷酸酶试剂盒说明书测定AKP含量。
1. 2. 7 磷吸收率测定 以硫酸亚铁法测定菌液中磷的含量（陈宁，2016）。取对数生长期菌液0.5 mL与0.5 mL（1 mg/mL）葡萄糖溶液和0.2 mL磷标准液混合。加药量和培养方式同1.2.3。分别在培养0、1、2、4、6、8、10和12 h时取0.1 mL菌液，加入1 mL三氯化铁与硫酸亚铁的混合液，静置10 min。4000 r/min离心5 min，取0.2 mL上清液，加入50 μL钼酸铵溶液，30 ℃水浴15 min，冷却后测定630 nm波长处的吸光值。
1. 2. 8 泳动能力试验 参考Lovato等（2019）的方法，配制含ESB的液体KB培养基和含ESB的0.3%固体KB培养基，培养基含ESB终浓度均为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL，等量的水和DMSO分别作为阴性对照和空白对照。对数生长期（107CFU/mL）的菌液在不同处理的液体培养基中28 ℃培养24 h后，分别吸取2 μL培养液滴加至相应的固体培养基上，28 ℃培养24 h后使用游标卡尺测量并记录菌落在固体培养基上形成的直径。
1. 2. 9 呼吸链脱氢酶测定 参照陶文卿（2012）的方法稍作改动，取对数生长期（107CFU/mL）的菌液3 mL，加入1 mg/mL的TTC溶液2 mL摇匀，加ESB处理同1.2.3，28 ℃静置培养2 h。滴加2滴浓H2SO4终止反应，加入5 mL甲苯振荡萃取产物，静置分层后取上层有机相4000 r/min离心5 min，以甲苯为空白对照测量490 nm波长处的吸光值。
1. 2. 10 扫描电镜（SEM）和透射电镜（TSM）观察
取对数生长期（107CFU/mL）的菌液，加入ESB使终浓度为MIC，等量DMSO为空白对照，摇床培养4 h。5000 r/min离心10 min，弃上清液，收集菌体，用pH 7.2的磷酸缓冲液洗涤3次，3%戊二醛固定。样本送成都里来生物科技有限公司进行电镜观察。
1. 3 统计分析
本研究所涉及的试验均重复3次。试验数据采用SPSS 16.0和Origin 9.0进行统计分析和图表制作。计量资料采用平均值±标准差表示，组间显著性分析采用单因素方差分析。
2 结果与分析
2. 1 菌种鉴定
利用特异性引物Psa_A1 F2（5'-GCCTCGATGT CGGCGC-3'）和Psa_A1R1（5'-ATTCGATAGAAGAA CTTCTTTGCGTTT-3'）对供试菌株进行PCR扩增，PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测。特异性引物Psa_A1 F2和Psa_A1 R1只能以Psa3为模板扩增出132 bp的条带，其他致病变种无法扩增（Andersen et al.，2018）。结果获得132 bp的特异性条带，说明供试菌株为Psa（图1）。
2. 2 抑菌圈、MIC、MBC和生长曲线测定结果
由表1可知，5种ESB浓度下Psa产生的抑菌圈直径均超过16.00 mm，与对照差异显著（P<0.05，下同），表明Psa对ESB敏感且具有浓度依赖性。梯度稀释、吸光度测定和平板涂布确定MIC和MBC均为2.4 mg/mL（表2）。ESB对Psa生长曲线的研究发现（图2），前4 h内试验组与对照组间无显著差异（P>0.05，下同），6 h后试验组菌体生长速度显著降低。表明ESB有抑制Psa生长的效果，抑制效果在一定范围内与浓度呈正相关。
2. 3 电导率测定结果
如图3所示，0 h时测定电导率发现，试验组的电导率均高于对照组，说明ESB能在短时间内影响细胞膜的通透性;对照组电导率前期平稳，后期呈上升趋势，可能与菌体的正常裂解、死亡相关;除1/4MIC试验组外，其他试验组的电导率均在短时间内迅速增加，极显著高于对照组（P<0.01，下同）。表明ESB影响Psa细胞壁的完整性且能改变细胞膜的通透性。
2. 4 可溶性蛋白测定结果
如图4所示，ESB处理Psa 3 h内，对照组培养液中的蛋白含量基本没有变化，而试验组蛋白含量均高于50 μg/mL，是对照组的9.00倍以上，最高达11.50倍;3～12 h试验组培养液中的蛋白含量均极显著高于对照组。表明ESB能迅速破坏Psa细胞膜结构，造成蛋白质泄漏，破坏程度在一定范围内与ESB浓度呈正相关。
2. 5 AKP测定结果
通过AKP试剂盒检测发现（图5），对照组的AKP活性基本未发生变化，试验组均呈前期上升后期稳定的趋势;比较8 h时AKP活性，试验组1/4MIC、1/2MIC、3/4MIC和MIC处理的AKP活性分别是对照组的7.57、14.43、20.57和27.43倍，达极显著差异水平。从AKP活性变化可推断，ESB能在短时间内破坏菌体的细胞壁，菌体细胞壁的破坏程度与ESB浓度呈正比。
2. 6 磷代谢测定结果
磷是生物生长必需元素之一。如图6所示，试验组的初始吸光度均高于对照组，可能是ESB中色素等物质干扰了吸光度的测定;分析1～10 h吸光度曲线发现，试验组1/4MIC、1/2MIC、3/4MIC和MIC处理的吸光度变化值（1 h与10 h吸光度差值）分别为0.001600、0.00860、0.02833和0.03500，对照组为0.07467，试验组与对照组间均达极显著差异;分析1～10 h磷代谢曲线斜率，对照组的磷代谢速率明显高于试验组。推断ESB能干扰Psa的磷代谢，影响Psa正常代谢和生长。
2. 7 呼吸链脱氢酶测定结果
呼吸链是细胞能量的主要来源，对生物生存至关重要。如图7所示，对照组在490 nm波长处的吸光度为0.1650±0.0035，加入ESB后Psa在490 nm处的吸光度极显著下降，随着ESB浓度的增加，吸光度分别下降至0.0950±0.0026、0.0660±0.0015、0.0350±0.006和0.0327±0.0050，与对照组相比分别下降42.31%、59.72%、78.74%和80.16%。表明ESB可影响Psa呼吸链脱氢酶活性。
2. 8 泳动能力试验结果
试验结果显示，培养基含ESB浓度超过0.4 mg/mL后即无菌落形成。从图8和表3可知，以固体培养基培养Psa时，0.2 mg/mL ESB能极大地抑制Psa的泳动能力（4组、5组与3组比较），与DMSO组相比抑制率超过30%（4组与3组比较），最高可达49.7%（5组与3组比较）;同为0.2 mg/mL ESB作用下，Psa在液体培养时受到ESB处理后会显著影响Psa在固体培养基上的泳动能力（5组与4组比较）。比较1组与2、3组结果可发现DMSO处理会造成Psa泳动能力受到影响。通过对Psa在不同情况下泳动能力的分析可知，ESB可显著抑制Psa泳动能力，阻碍细菌的迁移。
2. 9 病原菌细胞形态观察
扫描电镜下观察发现，对照组的Psa细胞结构完整，表面较光滑，无明显破损，表明DMSO对Psa形态影响较小（图9-A）;Psa在ESB MIC处理4 h后，细胞形态受到严重破坏，出现缩短、凹陷、畸形和破裂（图9-B）。透射电镜下观察发现，DMSO处理后的Psa菌体形态发生变化，出现轻微的凹陷和皱缩，部分区域出现空洞，但形态结构相对完整（图10-A和图10-B）;ESB MIC处理4 h后，Psa细胞结构被破坏，内容物流失严重，胞质密度下降，出现大面积的裂解（图10-C～图10-F）。表明ESB影响Psa细胞结构，造成细胞表面受损，内容物外泄，抑制Psa生长。
3 讨论
通过抑菌圈、MIC和MBC测定可知ESB能显著抑制Psa生长，抑制效果与浓度呈正相关。部分抑（杀）菌剂作用于细菌菌体后，能改变细胞膜通透性，造成细胞能量代谢失衡、生理活动受阻（Cox et al.，2001）。因此，培养液电导率的变化可反映细胞膜通透性的改变（Li et al.，2014）。本研究结果显示，ESB作用下Psa的胞内物质大量外泄，培养液电导率出现明显变化。本研究培养液中可溶性蛋白含量的测定结果与电导率的变化趋势基本一致，ESB处理后培养液中可溶性蛋白含量显著增加。蛋白质在细胞中发挥着重要的生理功能，蛋白含量的降低会影响细胞正常的生理功能（Yin et al.，2020）。同时，蛋白质的泄漏也是细胞膜完整性被破坏的标志之一（Bajpai et al.，2013）。AKP是一种磷酸水解酶，存在于细胞间质中，只有细胞壁遭到破坏后通透性增加，才能在胞外检测到AKP活性。胞外AKP活性可间接反映细胞壁的通透性变化（刘雪等，2019）。从AKP活性变化可知，ESB处理后Psa细胞壁通透性增加，细胞壁完整性被破坏。
磷参与生物多种化合物的形成，细菌代谢活动中磷的消耗可反映细胞的生长状态和代谢情况。从磷消耗曲线可知，试验组的磷消耗量显著低于对照组。分析磷消耗曲线的斜率也可得出相似的结论，对照组磷的消耗速率远高于试验组。TTC是一种小分子无色物质，能透过细胞膜，在呼吸链脱氢酶作用下被还原成红色的三苯甲酰（TF），该物质在490 nm波长处有最大吸收峰（Richter et al.，2007），490 nm波长处的吸光值可反应呼吸链脱氢酶活性。本研究4个浓度处理下的Psa呼吸链脱氢酶活性与对照组相比分别下降42.31%、59.72%、78.74%和80.16%，說明ESB能抑制呼吸链脱氢酶活性，干扰细胞正常的能量代谢，影响细胞生长。细胞的运动性对于细胞膜的形成是必须的（Dressaire et al.，2015），泳动能力的降低会抑制细胞膜的形成（Miao et al. 2021）。Miao等（2021）研究了黄芩苷作用下的铜绿假单胞菌的泳动能力，证明铜绿假单胞菌细胞膜的形成受到抑制。本研究中，当ESB浓度超过0.4 mg/mL时，0.3%固体培养基上无Psa生长，说明ESB能明显降低Psa的泳动能力，抑制Psa细胞膜形成。扫描电镜和透射电镜结果说明ESB作用下的Psa细胞结构受到破坏，正常的生长活动受到影响。
天然化合物成分丰富，不会造成环境污染和药物残留，是替代抗生素和铜类化合物的方法之一（Cameron and Sarojini，2014）。黄芩作为我国传统的中药，主要成分是黄芩苷和黄芩素等黄酮类化合物及其衍生物（Shen et al.，2018），具有抗菌、抗炎症等作用（Trinh et al.，2018;Da et al.，2019）。目前关于黄芩中有效成分抗菌试验已有研究报道（郭泽宇，2020;蒋长军等，2021;Do et al.，2021），但黄芩对Psa的抑制作用尚无文献报道。本研究以黄芩为基础，探究了ESB在细胞结构、物质和能量代谢等方面对Psa的影响，有关黄芩抑杀Psa的有效成分还有待进一步研究。
4 结论
ESB可破坏Psa的细胞结构，干扰物质和能量代谢，抑制菌体生长，具有开发成植物源杀菌剂的潜力。
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（責任编辑 麻小燕）
