UV-B辐射和施氮对满江红生长、矿质营养和抗氧化生理的影响

2022-05-25杨竞张光群李明锐湛方栋李元祖艳群何永美

农业资源与环境学报 2022年3期

杨竞，张光群，李明锐，湛方栋，李元，祖艳群，何永美

（云南农业大学资源与环境学院，昆明 650201）

臭氧衰减导致的地表UV-B 辐射（280～315 nm）增强是当今重大的全球气候变化问题之一[1]。UV-B辐射作为重要的环境因子之一，会诱导植物产生大量活性氧自由基（ROS），显著降低植物叶片光合色素含量、改变植株矿质营养含量、抑制抗氧化酶活性、阻碍抗氧化物质合成、导致植株生物量下降[2]。在一定范围内，植物启动自身的防御机制，通过提高超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、谷胱甘肽还原酶（GR）等抗氧化酶活性[3]、增加酚类、类黄酮等抗氧化物质含量来提高植物抗性[4]，以缓解UV-B的损伤[5-6]。氮素是植物生长发育的主要限制因子，施氮可提高植物抗性，也可改变植物对UV-B 辐射增强的响应[7-8]。因此，研究UV-B 辐射和施氮对植物的影响显得尤为重要，目前的研究主要集中在谷子、白菜、菠菜、藻类[9-10]等，对固氮植物满江红的相关研究报道较少。

满江红（Azolla imbricata）是蕨藻共生体，其生物量大、固氮量高，作为生物绿肥被广泛使用[11]。满江红体内的固氮蓝细菌（Cyanobacterium）通过固氮酶将氮气转化为可被利用的氨，供植物生长发育，植物固氮酶极易被氧化，其活性直接决定着满江红的供氮能力[12-13]，显著影响满江红参与稻田氮循环[14]。云南元阳梯田紫外辐射背景值高，梯田不施加化肥，依靠满江红等还田维持稻田氮循环[15]，这为研究UV-B 辐射和氮素复合作用的影响提供上佳的试验材料。因此，以元阳梯田稻田满江红为研究材料，UV-B 辐射和氮素作为影响因素，在项目组前期研究的基础上，基于元阳梯田的地域特点，研究UV-B 辐射和施氮单独及复合作用对满江红生长、矿质营养和抗氧化生理的影响，为认识元阳梯田满江红对UV-B 辐射与氮素养分的生理响应特征提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取云南元阳梯田水稻生长期（5—6 月）自然漂浮生长的满江红植株，带回试验室用蒸馏水冲洗数次，去除表面多余泥土和杂质，备用。

1.2 试验设计

光源设置：5.0 kJ·m-2UV-B 辐射强度，采用李元等[16]建立的方法在试验小区水面垂直距离40 cm处悬挂UV-B 灯管（光谱为280～315 nm），灯管长1.2 m，间距30 cm。自然光对照组只悬挂灯架不供应灯管。光源和培养液设置见表1，其中氮含量0 g·L-1的处理采用无氮霍格兰营养液[17]，氮含量0.06 g·L-1的处理采用30%霍格兰营养液[18]。

表1 试验处理Table 1 Experiment settings

将备用满江红随机接种至矩形塑料培养盆（31 cm×24 cm×11 cm）中连续水培18 d，接种量为水面面积的1/10，约3.0 g，每3 d 定量添加100 mL 蒸馏水补充蒸发量，共4 组处理，每组处理5 个重复，共20 个小区。UV-B辐照时间为9：30—17：30（光暗周期为8 h∶16 h），大棚培养温度（24±4）℃，相对湿度50%～70%。根据预试验结果，在第12 天时，CK 处理满江红长满试验小区水面，因此，统一将采样时间定为第12天。

1.3 生物量测定及生长系数计算

采用鲜质量称量法，每3 d 取出全萍过40 目筛，用纸吸干表面水分后称取鲜质量，称完后放回。按照公式（1）计算生长系数（K）[19]：

式中：W0是初始放萍量，g；W是实际萍体的鲜质量，g；t为间隔天数，d。

1.4 植株矿质营养元素测定

培养12 d 时取样，于105 ℃杀青30 min，70 ℃烘干24 h至恒质量。采用凯氏定氮法测定总氮含量，钼锑抗比色法测定全磷含量，火焰原子吸收分光光度法测定总钙、总镁含量[20]。

1.5 光合色素的测定

取鲜萍2 g 去根洗净，加入95%乙醇5 mL，冰浴研磨至匀浆，转移至离心管。于转速20 000 r·min-1离心10 min。取上清液在分光光度计波长665、649 nm 和470 nm 处测定吸光度。参照文献[20]计算叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量。

1.6 抗氧化物质和酶的测定

取鲜萍2 g 加入2 mL 的PBS 提取缓冲液[0.04 mol·L-1Na2HPO4，0.06 mol·L-1NaH2PO4，0.1%（V/V）Triton X-100，1 mol·L-1NaCl，10 g·L-1PVPP，pH：7.0]，在冰浴中研磨成匀浆。将匀浆移入离心管，另加1 mL的提取缓冲液，清洗研钵后也并入离心管中，混匀后于8 000 r·min-1离心15 min。取上清液置于分光光度计测定过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽还原酶（GR）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸（AsA）吸光度，具体波长和计算公式参照南京建成生物工程研究所SOD、POD、MDA、CAT 和总抗氧化能力（FRAP 法）测定试剂盒说明书。

取鲜萍1 g，在冰浴中研磨成匀浆，加入含1%盐酸的甲醇溶液，提取24 h，取0.5 mL提取液，用蒸馏水定容至25 mL，在紫外分光光度计280、325 nm 处测定吸光度，计算总酚含量，在305 nm 处测定吸光度，计算类黄酮含量[21]。

1.7 统计分析

试验结果以平均值±标准差（Mean±SD）来表示，用SPSS 12.0 统计软件对试验数据进行双因素方差分析和最小显著差法（LSD）显著性检验，显著性水平α=0.05。

2 结果与分析

2.1 UV-B辐射和施氮对满江红生长的影响

由图1 可知，以3 g 的初始放萍量记录连续水培18 d 的生长系数的变化。UV-B辐射和N处理导致满江红的生长速率在1～18 d 内均低于CK，在培养6 d 时生长系数最高，9 d 时和12 d 时生长速率无显著差异，18 d 时生长速率最低。CK 处理的满江红平均生长系数为0.102，UV-B+N、UV-B和N处理的平均生长系数低于CK 处理，分别为0.085、0.082 和0.080。UV-B+N、UV-B、N处理在各时期的K值均显著低于CK处理，UV-B+N、UV-B 和N 处理在各时期K值无显著差异。双因素分析表明，UV-B辐射处理、N处理对满江红生长系数有极显著影响，且两者存在交互作用。

图1 UV-B辐射和施氮对满江红生长系数（K）的影响Figure 1 Effects of UV-B radiation and nitrogen application on growth coefficient（K）of Azolla

由图2 可知，以3 g 的初始放萍量记录连续水培18 d的生物量变化。UV-B+N 处理、UV-B 辐射处理、N 处理在培养18 d 时满江红生物量均显著低于CK，UV-B+N 处理在培养9、12、15、18 d时生物量下降，降幅分别为10.6%、16.8%、22.6%、34.8%。UV-B 处理在9、12、15、18 d 时生物量下降，降幅分别为19.8%、26.7%、27.7%、36.1%。N处理在9、12、15、18 d时生物量下降，降幅分别为19.8%、18.4%、21.3%、30.0%。四组处理均在培养12 d 时生物量最高。UV-B+N、UVB、N 处理在3～18 d 的生物量均显著低于CK 处理，UV-B+N、UV-B 和N 处理在各时期生物量无显著差异。双因素分析表明，UV-B辐射处理、N处理对满江红生物量有极显著影响，且两者存在交互作用。

图2 UV-B辐射和施氮对满江红生物量的影响Figure 2 Effects of UV-B radiation and nitrogen application on biomass of Azolla

2.2 UV-B 辐射和施氮对满江红矿质营养元素含量的影响

与CK 相比，UV-B+N、UV-B、N 处理均显著增加了满江红N 含量，增幅分别为156.8%、136.1%、33.7%；UV-B+N 处理和N 处理显著降低满江红的P、Mg、Ca 含量，降幅分别为20.8%、38.5%、37.1% 和4.2%、36.0%、37.5%。双因素分析表明，UV-B、N处理对满江红N、Mg、Ca 含量有极显著影响，且两者存在交互作用。UV-B 处理对K 含量没有显著影响，三组处理均对满江红N含量影响显著，且有交互作用。可知UV-B+N、UV-B 辐射、N 处理均使满江红的N 含量增加，Mg、Ca含量减少（表2）。

表2 UV-B辐射和施氮对满江红矿质营养元素含量的影响（mg·g-1）Table 2 Effects of UV-B radiation and nitrogen application on the content of nutrients of Azolla（mg·g-1）

2.3 UV-B辐射和施氮对满江红光合色素含量的影响

与CK 相比，UV-B+N 处理显著降低了叶绿素a、类胡萝卜素含量，降幅分别为21.9%、43.6%。UV-B处理显著降低了叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量，降幅分别为21.1%、37.3%、41.0%。N处理显著降低了类胡萝卜素含量，降幅为41.0%。UV-B辐射条件下叶绿素b含量的降幅大于叶绿素a的降幅。双因素方差分析表明，UV-B 处理、N 处理对叶绿素a 和类胡萝卜素含量有极显著影响，且具有交互作用（表3）。

表3 UV-B辐射和施氮对满江红光合色素含量的影响（mg·g-1）Table 3 Effects of UV-B radiation and nitrogen application on photosynthetic pigment content of Azolla（mg·g-1）

2.4 UV-B辐射和施氮对满江红抗氧化物质含量的影响

与CK 相比，UV-B+N 处理显著增加了总酚的含量，增幅为160.2%。UV-B 辐射使满江红总酚和MDA 含量显著增加86.7%、69.5%，使AsA、类黄酮含量显著降低16.6%、57.8%。N 处理显著增加了AsA含量，增幅为14.7%。双因素方差分析表明，UV-B 处理和N 处理对MDA、AsA、类黄酮含量有显著影响，且对总酚、类黄酮含量的影响具有交互作用。三组处理均导致MDA含量显著增加（表4）。

表4 UV-B辐射和施氮对满江红丙二醛与抗氧化物质含量的影响Table 4 Effects of UV-B radiation and nitrogen application on MDA and oxidation product content of Azolla

2.5 UV-B辐射和施氮对满江红抗氧化酶的影响

与CK 相比，UV-B+N、UV-B 辐射、N 处理均显著增加SOD 活性，增幅为164.7%、189.3%、185.0%。POD 活性显著降低，降幅分别为8.17%、30.1%、29.4%，使GR 活性显著增加85.9%、69.5%、53.2%，对CAT 活性无显著影响。UV-B 辐射处理的总抗氧化能力是CK 的3 倍，N 处理使满江红总抗氧化能力显著提升82.1%。双因素方差分析表明，UV-B 处理和N 处理对总抗氧化能力和SOD、POD、GR 活性有显著影响，且具有交互作用（表5）。

表5 UV-B辐射和施氮对满江红抗氧化酶的影响Table 5 Effects of UV-B radiation and nitrogen application on antioxidant enzymes of Azolla

2.6 相关性分析

相关性分析结果（表6）显示，UV-B 辐射和N 处理的满江红生物量与类胡萝卜素、类黄酮含量呈显著正相关，与总氮、总酚含量呈极显著负相关，与MDA含量呈显著负相关。满江红总氮含量与AsA 含量呈极显著负相关，与类黄酮含量呈显著负相关，与MDA、总酚含量呈极显著正相关。满江红总抗氧化能力与AsA含量呈显著负相关，与总酚含量呈极显著正相关。

表6 满江红生物量、总氮含量与抗氧化物质及光合色素含量的相关性分析Table 6 Correlation between biomass，total nitrogen，oxidation products and photosynthetic pigment of Azolla

3 讨论

3.1 满江红生长对UV-B辐射响应的机理

生物量是所有生理、生化和生长因子的长期积累响应[2]。UV-B辐射抑制植物的生长发育及生物量[22]。本研究中，UV-B 辐射（5.0 kJ·m-2）处理使满江红的生长速率和生物量都低于对照组，在培养6～12 d 生长速率呈负增长，生长系数下降，表明UV-B 辐射缩短了满江红的生长周期，这与PRASAD 等[23]的研究结果一致。N 处理导致满江红磷、钾含量显著减少，而UV-B 辐射处理与CK 无显著差异，可能施氮会对满江红磷脂、磷酸合成和渗透压调节过程造成不利影响[24]，这与试验中观察到的满江红变黄和叶片萎缩的现象一致。UV-B+N、UV-B、N处理均导致满江红钙、镁含量显著减少，这可能是满江红的应激反应，不利于满江红叶绿素的合成。UV-B+N、UV-B、N 处理均导致氮含量显著增加，该结果与大多数研究不同，满江红氮含量与根部吸收作用和生物固氮作用有直接关系，是由于UV-B 辐射和施氮促进了满江红的氮吸收或固氮作用，这与满江红品种以及施氮量和时间有关。根部吸收和生物固氮过程与满江红氮代谢过程有关。

生长在不同氮浓度条件下的植物叶片光合作用对UV-B 辐射的响应程度不同[25]，本试验中UV-B、UV-B+N 处理显著减少满江红光合色素含量，N 处理下光合色素含量无显著变化，叶绿素a/b发生变化，使叶绿体的膜发生氧化作用，破坏叶绿体的膜结构[26]。本试验中施氮未能缓解这些损伤，这可能与满江红生育期和UV-B 辐射强度有关。综上，UV-B 辐射导致满江红矿质营养元素含量的变化，使满江红基础生理代谢受阻[27]，同时光合作用可能受到抑制，施氮未能缓解UV-B 辐射给植物带来的损伤，最终导致生物量下降。

3.2 满江红抗氧化代谢对UV-B辐射响应的机理

UV-B 辐射对满江红最重要的影响是诱导其产生过量活性氧（ROS）进而损伤质膜。同时，UV-B 辐射也会激活植物体内的两类抗氧化机制[28]：一种是抗坏血酸（AsA）、类胡萝卜素、酮类、酚类等抗氧化物质的非酶促反应，另一种是SOD、CAT、POD 和GR 的酶促反应。这些抗氧化酶和物质相互协调、相互作用，以缓解UV-B辐射给植物带来的损伤[29]。

MDA 是植物过氧化的最终产物之一，它间接反映了生物膜受损伤程度。本研究发现，与CK 相比，UV-B+N、UV-B、N 处理的MDA 含量均显著上升，且与生物量呈显著负相关，与总氮含量呈极显著正相关，这与相关研究结果[30]一致，满江红生物量下降与质膜受损程度有关。本研究中UV-B、UV-B+N 处理导致总酚含量显著增加，这与大多数研究相同，是满江红抗性的表现。而N 处理导致AsA 含量显著增加，AsA 与总氮、总抗氧化能力呈显著负相关，与生物量无显著相关性，AsA 与谷胱甘肽（GSH）、GR 等物质协同作用形成抗坏血酸-谷胱甘肽循环，可以清除ROS，UV-B+N、UV-B、N 处理均导致GR 活性显著增加，GR 能有效维持AsA-GSH 循环，但这不仅需要GR，还需要GSH 底物合成[31]。AsA-GSH 循环过程较复杂，要解释AsA 在N 处理下的含量增加还需进一步对该循环的其他物质和酶进行研究。UV-B+N、UV-B、N 处理均显著减少类黄酮的含量，类黄酮含量与生物量呈显著正相关，与总氮含量显著负相关，这可能是由于UV-B 辐射诱导产生的ROS 超出了满江红活性氧清除能力，对满江红叶片造成了进一步损伤。

SOD在氧化应激防御中起核心作用，其作用是将O2-转化为O2和H2O2，CAT 能催化H2O2，其转化率高，UV-B 辐射对CAT 活性的影响取决于其强度和持续时间[32]。与其他类似研究相同[33]，UV-B 辐射和施氮均导致满江红体内SOD、GR 活性提高，SOD 活性的显著增强可能会导致满江红O2-转化为O2和H2O2的转化率过高，部分H2O2可能会在体内累积。与大多数研究不同，本研究中UV-B、N 处理的满江红POD 活性显著下降，可能与满江红POD 对UV-B 辐射的敏感度有关[34]。一方面，UV-B 辐射激发了满江红的抗氧化代谢，使总酚含量显著增加，且施氮增加AsA含量，一定程度提升了满江红抗氧化能力。另一方面，SOD活性的提高程度可能超过了POD、CAT 对H2O2的转化率，导致H2O2累积并造成氧化损伤[35]，同时MDA 含量的显著上升也说明满江红受到了氧化损伤。

综上，UV-B 辐射引起了满江红的氧化应激反应，H2O2、-OH 和O2可能在满江红体内累积，UV-B+N处理对两种抗氧化机制都有所激发，总抗氧化能力显著提高；UV-B 辐射提高满江红抗氧化酶活性；施氮增加AsA 含量，总抗氧化能力显著增强，植物抗性增强；UV-B+N、UV-B、N处理可能均导致满江红质膜不同程度的损伤，而满江红抗氧化物质的含量增加利于其对生物量的累积，抗氧化酶活性的提高有利于其总抗氧化能力增强。满江红总氮含量与MDA 含量显著正相关，推测满江红的氮累积可能是由浓缩效应造成的。UV-B 辐射增强和施氮对满江红抗氧化机制的影响较复杂，还需进一步研究。