边界病的研究进展

李运娜，黄海碧，王 冠，戴晓光，王旭红，苏胜杰，贾 皓

（1.内蒙古自治区动物疫病预防控制中心，内蒙古 呼和浩特 010010；2.金宇保灵生物药品有限公司/兽用疫苗国家工程实验室，内蒙古 呼和浩特 010030；3.内蒙古自治区农畜产品质量安全中心，内蒙古 呼和浩特 010010）

边界病（border disease，BD）是由边界病病毒（border disease virus，BDV）感染引起的、小反刍动物绵羊和山羊的一种传染性疾病， 最早发生在英格兰和威尔士边界，所以得名［1］。 该病呈世界性分布，流行率因国家和地区而异，从5%到90%不等；死亡率取决于感染的时间、 感染毒株的毒力以及感染宿主的物种［2］。 该病的主要特征是繁殖障碍，母畜表现为不孕、流产以及产死胎、弱胎或畸形胎；羔羊表现为颤抖、被毛异常；有些绵羊也表现为黏膜样病变［3］。BDV 还可感染牛、猪以及其他种类的反刍动物［4-5］。 边界病通常是水平传播和垂直传播，羔羊可能会持续性感染（persistent infection，PI）。

BDV 在羊、猪、牛之间可跨种传播，给诊断带来了困难，同时对牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV） 的 根 除 产 生 一 定 影 响［6］。BDV 可以从驯化物种（猪、牛、羊）传播到野生物种（羚羊、美洲驼、羊驼、野牛和驯鹿等）［7］。 由于瘟病毒属成员之间存在广泛的交叉反应和种间传播，根据宿主种类、特定组织和器官中的定位、传播途径、临床症状、起源地区等确定BDV 感染的方法是不可行的；可以通过BDV 与其他病毒株的遗传和抗原相关性以及原始宿主对其进行鉴定［8-9］。 了解BDV 的病原学及流行病学特征有助于制定预防和控制BDV 感染的有效措施。 结合国内外近期研究报道，从病原学、流行病学、诊断措施等方面对边界病进行综述， 以期为该病的防控工作提供参考。

1 病原学

BDV 与牛病毒性腹泻病毒1 型 （BVDV-1）、牛病毒性腹泻病毒2 型 （BVDV-2）、 猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）同属黄病毒科瘟病毒属成员。 BDV 是一种球形、有囊膜的RNA 病毒（40～60 nm），基因组由单链正性RNA 组成，长度大约为12 300 个核苷酸；对脂类溶剂、紫外线、温度敏感， 对乙醚中等敏感；56 ℃处理30 min 可被灭活，在有机溶剂和洗涤剂中被迅速灭活，在外界环境中可存活数周； 可通过50 nm 的滤膜［10］。BDV 基因组包括5′和3′末端2 个非翻译区（UTR）和1 个开放阅读框（ORF），编码4 种结构蛋白，即衣壳蛋白（C）和3 种包膜糖蛋白（Erns、E1和E2）， 以及7 种非结构蛋白 （Npro、p7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B）［11］。

5′-UTR 是BDV 基因组中的高度保守区域，非结构蛋白Npro 的基因编码N 末端蛋白酶，E2蛋白在病毒附着和进入宿主细胞过程中起主要作用，可以诱导机体产生特异性中和抗体，抵抗BDV的感染。 通过比较5′-UTR、Npro 和E2 的基因序列对BDV 分离株进行分类，从而进行系统进化分析。 BDV 在系统发育上至少有8 个基因型（见表1）。 在GenBank 上有15 个完整的BDV 基因组序列（除BDV-6 外），全基因组序列比对显示，在核苷酸和氨基酸序列水平上， 种内相似性分别为72.9%～74.1%和78.6%～82.7%。

表1 BDV 各基因型及其分离的最初宿主

与BVDV 类似，根据BDV 对易感组织培养物的影响， 可分为2 种生物型： 致细胞病变型（cytopathogenic，CP） 和非致细胞病变型 （non-cytopathogenic，NCP）。 前者可导致受感染细胞空泡化和溶解，形成病毒蚀斑；后者不会导致可见的感染迹象［30］。 NCP 生物型比CP 生物型更容易分离，NCP 可在细胞培养中建立持续感染。 NCP 型的BDV 对于诱发致命的黏膜病变（坏死性化脓性炎症）至关重要，该种病变常见于绵羊［3，31］；CP 型的BDV 感染多见于山羊。

2 流行病学

2.1 易感动物及传播途径

绵羊是BDV 的自然宿主，山羊和某些反刍动物也可以感染边界病。 家养和野生动物存在种间传播， 边界病表现出较低的宿主特异性和广泛的宿主范围［7-8］。 病羊、持续性感染的羔羊以及带毒动物是该病的主要传染源， 持续性感染的羔羊是最重要的传染源；BDV 存在于流产的胎儿、羊水和持续感染动物的排泄物及分泌物中，因此，动物通过污染物感染该病。 边界病的传播途径包括垂直传播和水平传播，BDV 通过胎盘感染胎儿，导致母羊流产、胎儿死亡，甚至产生持续感染；持续感染动物无症状，几乎总是血清阴性，并不断通过分泌物和排泄物向环境中排泄病毒， 加速了该病的水平传播。

2.2 边界病的流行情况

BDV 呈全球性流行， 在欧洲和亚洲国家都有报道，包括法国、德国、意大利、荷兰、西班牙、印度、日本、中国等。 对分离自不同区域的BDV 分离株进行抗原和基因分类， 对于提高边界病流行病学的认识至关重要。 表2 列出了不同基因型BDV在各国的分布情况。 BDV-1、BDV-2 最初分别被称为BDV-A 和BDV-B， 由德国分离株组成［32］；BDV-3 和BDV-1 是欧洲最流行的基因型，BDV-1在世界范围内流行；BDV-4 在西班牙占主导地位［33］；BDV-5 和BDV-6 首次在法国报道［34］；BDV-7 最初在意大利发现， 且该基因型目前仅在意大利检测到［25］；BDV-8 由Caruso 等［26］和Peletto 等［27］分别从意大利的一只羚羊和一只山羊羔羊上分离，随后Peterhans 等［28］和Stalder 等［29］分别从瑞士的牛、羊和猪上检测到该基因型的毒株。

表2 不同基因型BDV 在各国的分布情况

2.2.1 边界病在国外的流行

1959 年，Hughes［1］首先报道了该病。 1984 年，从法国Aveyron 地区的绵羊中分离出一株BDV 毒株，该毒株使成年羊和羔羊患病，死亡率高；据调查在法国阿尔卑斯山脉野生动物群中瘟病毒的血清阳性率为41%，流行毒株多为BDV-4［43-44］。1997年，在西班牙东北部的羔羊中暴发了边界病，特点是死亡率高，临床症状与Aveyron 病相似［22］。 2001年，西班牙比利牛斯山脉中部和东部的羚羊发生了致命的边界病疫情，导致羚羊数量急剧减少（超过80%），威胁到该物种的生存，引起各国关注［45-46］。2011 年，日本首次对小型反刍动物进行了边界病流行病学调查， 将绵羊血清使用中和过氧化物酶连接抗体检测BDV 抗体，结果发现，日本北部地区BDV 血清阳性率为17.6%，大多表现为持续性感染，结果具有特异性，不包括与BVDV 的交叉反应［35］。 2009 年，Gur［47］对绵羊和山羊进行边界病调查， 发现瘟病毒血清学阳性率为3.0%～78.5%，分离的生物型包括CP 型和NCP 型。Hasbi 等［15］使用RT-PCR 技术在2013—2014 年采集的40 份野猪样本中检测到BDV-1，这也是土耳其学者首次在该国野猪体内检测到BDV。

2.2.2 边界病在我国的流行

在我国安徽省、江苏省、山东省、青海省等地的羊群中均发现有BDV 感染，并且调查发现在青海省羊群中存在BDV 和BVDV 混合感染。 2012年，李文良等［48］首次在安徽省和江苏省的腹泻羊中检测到BDV。 2013 年，刘霞等［42］对华东地区某羊场绵羊血液样品进行边界病感染情况调查，发现1 只绵羊血清样品为阳性； 通过病毒全基因组测序和遗传进化分析，证实该毒株属于BDV-3 亚型，这是继国内山羊中发现BDV 感染后，首次在绵羊群中发现BDV 感染。 2014 年，彭程等［49］从采集自山东省外观健康羊群的257 份鼻拭子样品中，检测到1 份样品含有BDV，这是首次在山东省羊群中检测出BDV， 推测该病可能来自活羊的跨省传播。 2017 年，陈云政等［50］采用RT-PCR 方法对青海省的健康羊血清样品（161 份）和腹泻羊的组织样品（34 份）进行BDV 和BVDV 核酸检测，发现检测样品中存在BDV 或BVDV 单独感染以及二者混合感染，个别养殖场（户）的羊群感染严重； 健康羊血清样品BDV 的总体阳性率为11.8%，BVDV 的总体阳性率为26.71%；腹泻羊组织样品BDV 的总体阳性率为26.47%，BVDV 的总体阳性率高达44.12%；该研究证实青海省羊群中存在BVD 和BD 混合感染。

3 诊断方法

由于BDV 和CSFV、BVDV 感染有类似的临床症状， 而瘟病毒属病毒之间又存在血清交叉反应， 边界病的诊断通常采用临床诊断与多种检测技术结合的方式。

3.1 临床症状与组织病变

边界病的典型症状是母羊的繁殖性疾病症状（流产、 产弱羔）， 以及羔羊的神经系统疾病症状（骨骼肌震颤）。 神经症状主要是由中枢神经系统神经纤维的髓鞘缺陷导致的。 绵羊的产后感染往往是轻微的，特点是轻度发热和短暂的淋巴痛，然后是血清转化［2］。在绵羊的急性BDV 感染中，偶尔会出现高死亡率［44］。 如果感染发生在妊娠期的前2 个月（即胎儿具有免疫能力之前），如果胎儿存活下来， 则新生儿将是一只PI 动物， 特征是对BDV 具有特异性免疫耐受性，缺乏抗体，在整个生命周期内持续排毒。 BDV 的PI 动物可能外观正常， 但通常生长不良， 有骨硬化或骨质疏松样病变，预期寿命较低［6］。 若感染母羊流产，则胎盘出现局灶性、坏死性炎症。

3.2 实验室诊断

边界病的实验室诊断主要包括病原的分离鉴定、核酸检测以及血清学检测技术，病原的分离鉴定是诊断该病的“金标准”。

3.2.1 病原的分离

将疑似病例的血清或经研磨处理的疑似病料在MDBK 细胞上培养， 观察细胞病变。 该方法适用于CP 生物型BDV，对于NCP 生物型BDV 还需结合RT-PCR 方法对培养物进行病毒鉴定。 该方法费时耗力，不适合大规模流行病学调查。

在难以分离获得病毒的情况下， 可以用干扰试验证明BDV 的存在。BDV 在原代犊牛睾丸细胞上可以干扰BVDV 的生长， 而且该种干扰作用可以被特异性抗血清中和。

3.2.2 血清学诊断技术

3.2.2.1 病毒中和试验（VNT）

由于BDV 感染过程复杂，且存在PI 情况，被感染牲畜表现为免疫耐受和体内抗体滴度低，病毒中和试验特异性强，可以利用VNT 法检测BDV抗体。但是该方法操作复杂且检测周期长，不适合大批量样品的检测。

3.2.2.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）和交叉血清中和试验（SNT）

ELISA 操作简单，在大批量流行病学调查时，优势突出。 2011 年，土耳其学者Mehmet T 等［51］使用ELISA 法， 对随机采集的465 份绵羊血液样本进行了分析， 以确定是否存在瘟病毒（BVDV、BDV）抗体；据估计，样本动物和样本城镇的瘟病毒血清流行率分别为75.9%和60.0%～82.5%。 由于瘟病毒的血清学交叉反应特性，ELISA 对BDV的血清学检测不能区分BVDV 和BDV 感染。 SNT法可以区分BVDV 和BDV 的感染， 通过Logistic回归分析，识别物种间传播的潜在风险因素。2017年，瑞士学者Kaiser 等［6］应用SNT 法对3 种瘟病毒 （BVDV-1a、BVDV-1h 和BDSwiss-a 亚型的毒株） 进行流行病学分析， 以充分区分BVDV 和BDV。 该研究首次确定了瑞士血清阳性牛的BDV血清流行率； 通过对畜主和对照农场进行问卷调查，收集流行病学信息，结合Logistic 回归分析，确定牛和羊的共同生存空间是牛感染BDV 最重要的风险因素。

3.2.3 病原学检测

目前常用RT-PCR 技术检测血液或者组织中的BDV。 以5′-UTR 基因或者Npro 基因为检测靶标，根据BDV 基因组序列设计特异性引物，可检测病变组织或者血清中的BDV。 2011 年，Toplu 等［52］使用RT-PCR 技术在自然感染的羔羊中检测出BDV。 2012 年，西班牙学者Fernández-Sirera 等［53］应用RT-PCR 技术在羚羊中检测到BDV， 同时，对4 株BDV 毒株和1 株BVDV 毒株，应用病毒中和试验进行检测，结果表明所有羚羊有BDV 特异性抗体。

4 防控措施

目前，尚无有效的BDV 疫苗。 尽管美国及一些欧洲国家，已经生产出了灭活全病毒疫苗，但仍未上市［54］。 使用BVDV 疫苗进行免疫，对BDV 的保护效果不佳（在短时间内有部分保护作用，但是接种疫苗2 个月后血清抗体呈阴性）。虽然这两种病毒在抗原上相关， 但并不能提供充分的交叉保护［55］，因此，对于边界病主要采取综合防控措施。一是，要尽早诊断，及时淘汰病畜，清除PI 动物，切断畜群中潜在的传染源，并对饲养环境消毒；二是，加强口岸检疫，禁止从有边界病流行的国家或地区引入种畜；三是，养殖户要做好防范，防止该病在野生动物和家畜之间传播。

5 小结

迄今为止，至少有8 个基因型的BDV 在世界范围内传播。 BDV 基因组中的基因变化可以改变毒力，新的绵羊瘟病毒也可能会出现，从而影响该病的流行病学。 在畜牧业发达的国家了解边界病的流行病学特征十分必要。

对我国来说，边界病是一种外来动物疫病，养殖户对其了解较少，危害性可能被低估。BDV 引起母羊繁殖障碍，产下PI 羔羊，不利于养羊业的健康发展。 由于BDV 在抗原和基因上与BVDV 及CSFV 相关， 可能对牛构成重大风险， 影响牛场BVDV 净化。 同样，猪群中存在BDV，可能会导致CSFV 诊断的不确定性，因此，应该对BDV 引起足够重视，了解其流行特征，及时、准确作出诊断，淘汰感染羊只，做好综合防控措施。