不同脱毒技术对马铃薯病毒脱毒效果的影响

古丽米拉·热合木土拉，徐琳黎，孙 慧，杨茹微

(新疆农业科学院 综合试验场，乌鲁木齐 830001)

马铃薯是以营养器官繁殖的无性繁殖作物，在种植过程中，容易感染病毒，病毒侵染马铃薯植株后会逐代传递并积累，最终导致马铃薯植株生长衰退、植株变矮、叶面皱缩、叶片出现黄绿相间的嵌斑，甚至叶脉坏死直至整个复叶脱落、块茎小或出现尖头龟裂，使产量降低，品质下降，这种现象称为马铃薯的退化[1～3]。马铃薯生产中病毒病一旦发生，没有很好的防治办法。目前也还没有任何药剂可以治疗马铃薯植株体内的病毒而不损伤马铃薯。因此，控制种薯带毒率，对侵染病毒的马铃薯进行茎尖组织培养，脱除病毒，再结合病毒检测手段，获得真正的脱毒苗是解决马铃薯退化最先进的技术措施之一[4]。近年来植物组织脱毒技术发展迅速，除了传统的茎尖剥离技术以外，热处理技术和化学处理技术也广泛应用于植物组织脱毒技术中[5]。但是目前国内的研究来看传统的茎尖剥离技术技术茎尖成活率低，脱毒处理时间长等不足，而热处理技术和化学处理技术存在对材料的处理时间温度及药品用量还没有一个完善的研究结果[6]。因此要针对马铃薯病毒病的发病机理，从不同的热处理及化学处理方法来深入研究对比，可以有效地解决马铃薯病毒性退化，提高马铃薯产量。

1 材料与方法

1.1 试验材料

实验材料为新疆农业科学院综合试验场马铃薯实验室提供的已侵染不同马铃薯病毒的试管苗，共3个品种：J11试管苗株系只带马铃薯 Y病毒; 陇10试管苗株系只带马铃薯 V病毒; T9 试管苗株系只带马铃薯 S病毒;

食物品质优才能避免拉肚子，喂新鲜鱼也可以，建议将鱼打成鱼酱投喂，一定是入冰柜急冻为好，太久吃不完的食物处理掉。冰冻的食物解冻到常温再去喂。

1.2 试验试剂和仪器

6-BA,GA3,NAA, MS培养基，病毒唑，组培室，无菌操作间，超净工作台，显微解剖镜，茎尖剥离工具，光照培养箱，一次性针头，微量离心管，PCR管，病毒检测试剂盒及仪器。

1.3 试验内容和方法

按照常规的组培过程在已灭菌的超净工作台内对实验材料进行茎尖剥离技术。本实验脱毒技术为三种，分别为茎尖剥离技术，热处理+茎尖剥离技术及化学处理+茎尖剥离技术。

酶联免疫吸附反应法检测步骤：

1.3.2 热处理+茎尖剥离方法 按组织培养操作流程将茎段转切到基础培养基中，每瓶放入10个茎段，培养。组培苗幼苗 7 d 生根后放入人工培养箱中进行变温处理。温度 26℃/19 h,38℃/5 h 交替进行，光照强度2 000 lux,光照时间为12 h/d。处理周期分别为 3 周、4 周和 5 周，以无热处理茎尖剥离的组培苗做对比。热处理后的茎段在超净工作台内，利用显微解剖镜剥离带有 1 个叶原基的茎尖，每个处理剥离 30 个。将茎尖接种至茎尖培养基中，在光强2 000 lux,光照时间为16 h/d,培养温度(23士2)℃的条件下培养。接种 8 周后统计成活率，接种 12 周后统计成苗率。接种 12 周后，将成苗茎尖转切到 MS 培养基中，待成苗后进行病毒检测。

声波在煤岩体传播过程中遇到异常体时，如断层、陷落柱、煤层异常变化带等，其传播路径及参数会发生部分改变，通过声波探测可以获得异常体的位置及规模。冲击地压的发生往往是应力局部化和缺陷局部化造成的，这也是为什么采掘活动接近煤柱、断层、煤层赋存急剧变化等异常区域时较易发生冲击地压的原因。通过声波探测技术获得异常区域的位置及其大小，就能间接获得冲击危险区域位置及其严重程度，因此该技术较多的应用于冲击危险预评价及危险区域划分。

1.3.3 茎尖剥离+化学处理 化学处理方法用的试剂为病毒唑。待茎尖培养基灭完菌还未凝固时，将用无菌水溶解好的不同浓度的病毒唑溶液用一次性针头注射到MS培养基中，加入的病毒唑浓度分别为25 mg/L、35 mg/L和45 mg/L。待加入病毒唑的培养基凝固后，将实验材料接种到备好的培养基中置于组培室经培养。培养三周后经上述茎尖剥离法(1.3.1)得到茎尖，置于茎尖培养基中培养。每个处理剥离30个。接种6周后统计成活率，10周后统计成苗率。12 周后将成苗的茎尖接种到MS培养基中，置于组培室培养。培养温度为 22℃-23℃，光照 16 h/d,光强 2 000 lx。待成苗进行病毒检测。

三是要有好装备。首先当然是车辆。越野车是首选，没有越野车也得质量相对过硬一些。因为所到之处，有些是尚未开放的景区或景点，道路设施不太完善，逢山爬山，遇水涉水。不能后退，只有前进。另外，“零件”也不可忽视。想爬山最好准备登山杖，想去沙漠最好备好沙地鞋，还有什么水具、地图、指南针、照明灯、太阳眼镜、雨伞、防晒衣、防晒霜、药品等等，总之宁可备而不用，不可用而无备。

1.3.5 病毒检测 本实验采用酶联免疫吸附反应检测法对供试材料进行病毒检测

1.3.1 茎尖剥离方法 在已灭菌的超净工作台内利用显微解剖镜剥离带有1个叶原基的茎尖，每份材料剥离 40 个茎尖，将茎尖接种至茎尖培养基中以 MS+琼脂4.5 g/L+白糖30 g/L 为基础培养基，另附加不同浓度 GA3，NAA 和 6-BA。接种后茎尖置于组培室培养，温度(23士2)℃，光照 16 h/d,光强 2 000 lx。接种 8 周后统计成活率，接种 12周后统计成苗率并将成苗的茎尖转切到 MS 培养基中培养后进行病毒检测。

⑦用酶标仪在405 nm波长下检测结果。阳性结果：微孔中有明显颜色变化；阴性结果：微孔中没有明显颜色变化。

1.3.4 数据统计 成活率，茎尖分生组织发育为可见的绿点谓之成活；成苗率，成活茎尖长出带有两个以上叶片的小植株谓之成苗；脱毒率为无病毒植株数与检测总株数的百分比。

④洗版。卵育结束后，将反应孔中的试剂倒出，加入250 uL的PBST缓冲液，之后快速导出，重复6～8次。将微孔板倒扣在吸水纸上以控干孔中残留液体。

病株主要特点：该病主要是由于病菌从植株根部进入，进而在植株体内蔓延，以此来危害玉米根部和玉米茎。最初的病症会造成玉米根部和茎部木质部分变成褐色，然后根部会逐渐坏死，包括次生根都会坏死，最后导致整个根茎部全部腐烂，引起植株的枯死。而地上部分一开始会由于缺乏养分叶片变黄，后续因为没有养分病株变得枯黄。

③配制的ECI缓冲液稀释到1倍，按酶标记物标签上的稀释倍数将酶标记物加到ECI缓冲液中，混合均匀。

②取0.35 g马铃薯组织放入研磨袋中加入1 000 uL的样品提取液，继续研磨。将研磨好的植物组织液装入离心管中离心30。吸取100 uL的上清液加入提前准备好的微孔板中，加入阳性及阴性对照，在恒湿箱中卵育2 h。

热处理结合茎尖剥离成活率及脱毒率方差分析结果显示(表 3)，经过 3 种不同周期热处理的茎尖成苗率及脱毒率差异不显著，成苗率有显著性差异。不同处理周期中3周热处理的植株成活率最高，但成苗率和脱毒率较低，4周热处理的植株成活率和3周热处理无明显差异，成苗率则最高，脱毒率最低。由表3可见，5周热处理的植株的成活率，成苗率均在中等水平上。但是脱毒率明显高于其他周期热处理的植株，最高达到了100%。以此对比的为无任何热处理的植株，成活率及成苗率上都低于3周和4周热处理周期的植株的成活率及成苗率，但是脱毒率则高于后两个处理的植株的脱毒率。这说明3周和4周热处理没有达到任何增强脱毒的效果。

⑥卵育结束前15分钟，制备PNP底物溶液，用PNP缓冲溶液溶解PNP底物片。再讲微孔板拿出进行洗版，步骤同上④，重复8次。再各反应空中加入100 UL的PNP底物溶液，恒湿箱中卵育60 min。

①按照说明书配比，配制PBST缓冲液，通用提取缓冲液(GEB)，ECI缓冲液及PNP缓冲液。

2 结果与分析

2.1 茎尖剥离技术对马铃薯不同病毒的脱毒效果

表1表明，在茎尖剥离法中剥离了只带一个叶原基的茎尖作为实验材料，3个不同品种材料茎尖的成活率和成苗率中等水平。3种病毒中脱毒率最低的为马铃薯S病毒，脱毒率仅为32%，脱毒率最高的马铃薯V病毒，脱毒率达到68，马铃薯Y病毒脱毒率与V病毒脱毒率没有明显的差异。此结果表明马铃薯 S 病毒在生长点很近处也有分布，属于较难脱的病毒。相比之下马铃薯V病毒在成活率及脱毒率的综合考虑下表现为最好，因此马铃薯V病毒适合用茎尖剥离方法来脱毒。

表1 不同品种茎尖剥离技术培养的茎尖组织的成活率及成苗率的影响

2.2 热处理加茎尖剥离技术对不同马铃薯病毒脱毒率的影响

实验设计的热处理温度为 26℃,19 h,38℃,5 h 交替进行，光照强度2 000 lux,光照时间为12 h/d。处理周期分别为 3 周、4周和 5 周，以无热处理茎尖剥离的组培苗做对比。表2 结果可见，经过三种不同热变温处理之后茎尖剥离的植株成活率及脱毒率没有呈现规律性变化。三种不同病毒的脱毒率比较中3周热处理马铃薯Y病毒的脱毒率最低20%。而在5周热处理水平上达到了86%的脱毒率，其他V病毒以及S病毒同样也在5周热处理水平上达到了最高脱毒率100%和96%。而3周和4周热处理的植株的脱毒率明显低于无任何热处理茎尖剥离的植株。以上结果表明热处理周期对不同病毒脱毒效果有一定的影响，从整体水平来看，马铃薯V病毒脱毒率最高，其次是马铃薯S病毒，马铃薯Y病毒的脱毒率为最低。

There was no significant difference in length of postoperative hospital stay.

表2 经过热处理+茎尖剥离脱毒技术培养的茎尖组织成活率，及脱毒率统计

⑤微孔板中加入100 UL酶标记物稀释液,在恒湿箱中卵育2 h。

表3 热处理结合茎尖剥离成活率及脱毒率分析结果

2.3 化学处理加茎尖剥离技术对不同马铃薯病毒脱毒率的影响

茎尖剥离结合病毒唑方法中，首先将带实验材料单个切段，接种到带有不同浓度病毒挫的培养基中(浓度为25 mg/L、35 mg/L和45 mg/L)培养三周后茎尖剥离，以无加入病毒挫的培养基培养的茎尖作为对照。再对其进行成活率及成苗率统计。由表4可见，对于不同马铃薯病毒不同病毒唑浓度处理，培养基中的病毒唑浓度的变化与茎尖生长率脱毒有明显关系。对于三种不同病毒的脱毒效果比较中，马铃薯Y病毒在35 mg/L和45 mg/L水平上出现的100%的脱毒率，但是45水平上的成苗率才13%，明显低于其他浓度处理的的出苗率。马铃薯V病毒则在45 mg/L水平上出现了最高脱毒率100%，而且此处理中植株成活率和成苗率也在比较高的水平分别为93%和47%。马铃薯S病毒病毒在25 mg/L水平上出现了最高脱毒率92%。三种病毒脱毒率以未加入病毒唑培养的植株脱毒率作为比较，除了45 mg/L处理的马铃薯S病毒以外其他处理的脱毒率均高于未加入病毒唑剥离的茎尖的脱毒率。这说明，病毒唑加茎尖剥离的植株脱毒率并未随着病毒唑浓度的提高出现规律性变化，因此病毒唑浓度对脱毒率的主要因素，但是对提高脱毒率有一定的影响，通过茎尖剥离结合病毒唑法脱毒率可以有效提高Y病毒的脱毒效果。

表4 经过病毒唑+茎尖剥离脱毒技术培养的茎尖组织成活率，及脱毒率统计

由表5可知 3种不同处理成活率之间的差异分析结果。无病毒唑加入的茎尖的成活率与病毒唑浓度为 25 mg/L,35 mg/L ,45 mg/L处理的成活率有显著差异，各处理成苗率及脱毒率之间的无显著性差异。成活率及成苗率最高的病毒唑浓度 35 mg/L，成活率达到95.67%。其次是25mg/L 成活率为89%，未加入病毒唑培养的植株的成活率最低64.67%。各个处理的成苗率上则没有明显差异，出苗率均在33%左右。脱毒率最高的为25 mg/L 浓度，达到85%。其次的为45 mg/L和35 mg/L，以上水平均高于未加入病毒唑的植株的脱毒率。3个不同病毒的脱毒率均在35 mg/L水平上达到最高，当浓度到了45 mg/L时成活率及脱毒率都开始规律性下降。这说明高浓度的病毒唑浓度对植株的生长状态有一定的影响，也不利于提高茎尖的脱毒效果。

表5 茎尖剥离法结合病毒唑处理的成活率及成苗率分析

3 讨论

(1)通过茎尖剥离对不同病毒剥离的茎尖的成活率、成苗率以及多种病毒的脱除效果比较可知,马铃薯S的脱毒率极低，在 32%左右；马铃薯V病毒在各试验处理中表现为最易脱除,脱毒效果在各品种表现均达到 68%。马铃薯Y病毒脱毒率与V病毒脱毒率无差明显的差异。从国内大量的研究内容来看，马铃薯病毒种类中最难脱除的为马铃薯S病毒和马铃薯X病毒，都需要切去带一个叶原基的茎尖，才能达到脱毒的效果而，且茎尖的成活率与茎尖的大小，带的叶原基数量有非常重要的关系。茎尖越小,成活率越低,脱毒率越高;反之,茎尖越大,成活率越高,脱毒率越低[7]。本次实验的茎尖剥离技术中只取一个叶原基培养茎尖之后结果也比较符合以上观点。实验中马铃薯S病毒的脱毒率达到32%。但是成苗率极低，也就失去了实际的使用价值。因此利用茎尖剥离技术脱去S病毒时取的茎尖大小如何选择还需要做更多的研究。

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(2)热处理加茎尖剥离脱毒处理中，在进行不同变温处理再经过茎尖剥离脱毒培养后，其成活率、成苗率和各种病毒的脱除效果均为最好的还是马铃薯V病毒，其次是马铃薯S病毒，而脱毒效果最差的是马铃薯Y病毒。根据 Dawson 和 Coworker 研究证明植株在 40℃高温处理时，病毒和寄主 RNA合成都是较为缓慢的，而植物正常生长能适应的极限温度为 42℃[8]。但是由于本实验用的材料为组培苗，而常规组培苗比较幼嫩，耐高温能力弱，持续高温可能会造成组培苗不同程度的烧苗甚至死亡,所以这次实验热处理最高温度选择在38℃。Dawson 和 Coworker 同时指出热处理的下限温度达 25℃时，病毒寄主RNA 的合成便立即恢复，即植物完全恢复正常生长状态，但4～8 h后病毒 RNA重新恢复合成功能，因此在最高温度、最低温度以及处理时间中间找到一个平衡点，既能脱除病毒又不影响植株正常生长是成功脱毒的关键问题。张婧颖也茎尖剥离法结合热处理法在 39℃(6h)+26℃(18h)交替处理，得到较好的脱毒效果[9]。笔者试验在热处理结合茎尖剥离处理法中，选择热处理温度为26℃/19h,38℃/5h，交替时间5 h，由结果显示，三种病毒在5周热处理时均可达到较高的脱毒率，其中马铃薯S病毒也可达到96%的脱毒率。但是在变温处理过程中部分4周热处理的植株和5周热处理的植株都出现，植株生长缓慢，叶片皱缩等现象。因此，对于热处理时间和温度还需通过试验进一步研究，需要找出脱毒效果更好的时间和温度。

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(3)试验参考 Klein、Cassel、Heide Bittner、Nagayoshi[10]、Peter L.Conrad[11]等研究，将病毒唑加入培养基中，将病毒唑与茎尖剥离法组合进行脱毒试验。试验结果表明病毒唑与其他方法相结合具有较好的脱毒效果，比起传统的茎尖剥离方法病毒唑组合茎尖剥离方法能得到更高的脱毒率。通过此方法将马铃薯病毒脱毒率可高达100%，尤其是马铃薯Y病毒和马铃薯V病毒。最难脱除的马铃薯S病毒的脱毒率也可以达到92%。笔者试验还发现将不同浓度病毒唑放入培养基中对组培苗的生长产生不同程度的影响。随病毒唑浓度增加组培苗产生植株矮小和分叉现象增多，25 mg/L和35 mg/L浓度影响较小、45 mg/L浓度影响较大，植株出现生长缓慢，叶片微黄等现象。将病毒唑应用于马铃薯脱毒技术，国外很早就有试验研究，而我国在这方面研究还非常少，杨琼芬[12]曾研究使用病毒唑防止细菌对脱毒苗浸染，取得了良好的效果。因此根据我国马铃薯品种及常见病毒如何将病毒唑运用于马铃薯脱毒，从而提高马铃薯脱毒技术进展，还需进一步研究。