不同产地大麦培曲微生物群落结构演替研究

任婷月，李永强，王晓勇，韩 英，甄 攀

（山西杏花村汾酒厂股份有限公司技术中心，山西汾阳 032205）

“曲为酒之骨”，大曲的质量直接影响清香型白酒的产量和质量。大曲作为酿酒的糖化发酵剂，在酿酒过程中起着糖化、发酵、生香的作用，直接或间接影响酒体的品质和风格。清香型大曲是以大麦、豌豆为主要原料，采用自然接种，中温发酵培养的一种粗酶复合制剂。大麦是清香型白酒大曲的主要原料，不同产地来源的大麦由于淀粉含量、蛋白质含量、千粒重、发芽率、内生菌等指标的不同，在一定程度上决定了它们制曲性能的不同，包括培曲过程中微生物群落结构的演替。目前，对于不同产地来源不同品种大麦理化特性及其制曲性能研究较少。

高通量测序技术可以对一个物种的转录组和基因组进行细致全面的分析，可以快捷方便的读取样品中复杂的微生物结构，具有明显的先进性和优势，是分析复杂多菌种样品的首选方法。目前，高通量测序技术已经运用于各种分子生物学领域，包括人体微生物、水中微生物、土壤微生物群落研究等。相关大曲微生物群落结构的研究已有开展，李晓然等运用克隆文库和焦磷酸测序对汾酒大曲制曲和储存阶段的细菌和真菌多样性进行了研究；杨旭等采用高通量技术解析了白酒中高温大曲细菌与真菌群落结构；关凯乐采用高通量测序技术对清香型白酒大曲和酒醅发酵过程中微生物群落结构演替进行了研究。但是不同产地来源的原料对于大曲发酵过程中微生物群落结构演替规律影响的相关研究非常少。

本研究采用高通量测序方法跟踪不同产地来源大麦培曲发酵过程，对比分析大曲发酵过程中微生物群落结构演替规律的变化，旨在为清香型白酒制曲原料大麦的选择与丰富提供合理依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

供试大麦：山西产地来源的冬性大麦品种，标记为SY，对照品种为甘肃产地来源的清香型白酒制曲大麦品种，标记为DZ。

山西冬性大麦与清香型白酒制曲大麦品种培曲发酵过程样品：依据制曲工艺确定本研究取样节点，选取大曲发酵天数0 d、2 d、4 d、9 d、13 d、18 d、24 d 作为取样节点，试验组与对照组分别标记为：SY0、SY2、SY4、SY9、SY13、SY18、SY24 和DZ0、DZ2、DZ4、DZ9、DZ18、DZ24。随机抽取3 块具有节点代表性的大曲，无菌袋封装，放入冰盒内，迅速带回实验室进行样品处理。

试剂及耗材：2×Taq Plus Master Mix，Vazyme；Agencourt® AMPure® XP(核 酸 纯 化 试 剂 盒)：Beckman Coulter；KAPA Library Quantification Kit(文库定量试剂盒)，KAPA；MiSeq® Reagent Kit v3(600 cycle)(PE300)，illumina。

仪器设备：Eppendorf 高速台式冷冻离心机，Eppendorf；电泳仪，Bio-Rad；ABI 9700 PCR 仪，ABI；凝胶电泳成像分析系统，UVP Bioimaging System；Agilent 2100 生物分析仪，Agilent；Labchip GX生物大分子分析仪，PerkinElmer；ABI Qpcr仪，美国ABI；高通量二代测序仪，illumina。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取

称取实时采集的大曲样品50 g 溶于450 mL 无菌水中，振荡混匀，吸取菌悬液50 mL 于离心管中，4 ℃下以13000 r/min 高速离心20 min，弃上清液，液氮速冻；准备混合裂解液（800 μL 月桂酸钠提取液+20 μL 溶菌酶+20 μL 溶壁酶）于2 mL 离心管，轻轻混匀，放置冰上；研钵以液氮预冷，将样品置于研钵中，倒入液氮，迅速研磨至粉末级，期间定时加入液氮，防止研磨过程中样品降解；将研磨好的粉末转移到混合裂解液2 mL 离心管中，置于涡旋振荡仪15～20 min；用移液枪向2 mL 离心管中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），缓慢摇匀；4 ℃下以12000 r/min 离心10 min 后取出，吸取上清液于新灭菌的2 mL 抽提试管中；向上述离心管中加入10 μL RNAase，37 ℃下放置30 min；加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），4 ℃、12000 r/min 离心10 min；吸取上清液于新灭菌的1.5 mL抽提试管中；向上述抽提管中加入0.7倍体积异丙醇，上下缓慢颠倒数次，置于-20 ℃下30 min；4 ℃、12000 r/min 离心20 min；倒掉上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次，真空干燥；加入20 μL的双蒸水（ddHO）溶解30 min；-20 ℃保存备用。使用Nano-Drop 2000 型超微量分光光度计测定其浓度和纯度。

1.2.2 PCR扩增

利用细菌核糖体16S rRNA基因的V3—V4高变区进行扩增，建立克隆文库测序，相关引物对为338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')。真核微生物扩增的序列为非编码rRNA 的ITS2 区域，相关引物对为:ITS3(5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。对不同节点样品的通用引物进行特异性设计，加入含有特异的8 个碱基的序列标签(barcode)进行区分。PCR 反应体系（总体系为25 μL）：12.5 μL 2xTaq Plus Master Mix、3 μL BSA（2 ng/μL）、1 μL Forward Primer(5 μM)、1 μL Reverse Primer(5 μM)、2 μL DNA（加入的DNA 总量为30 ng），最后加入5.5 μL dd HO 补足至25 μL。反应参数：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s，28 个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增目的条带大小，并用Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒纯化。

1.2.3 MiSeq 测序

PCR 产物用于构建微生物多样性测序文库，在北京奥维森基因科技有限公司使用Illumina Miseq PE300 高通量测序平台进行Paired-end 测序。测序原始序列上传至NCBI 的SRA数据库。

1.2.4 数据分析处理

下机数据经过QIIME1（v1.8.0）软件根据Barcode 序列拆分样本，使用Pear（v0.9.6）软件对数据进行过滤、拼接。去除打分值低于20，含有模糊碱基，引物错配序列。拼接后使用Vsearch（v2.7.1）软件去除长度小于230 bp 的序列，并根据Gold Database 数据库用uchime 方法比对去除嵌合体序列。使用Vsearch（v2.7.1）软件uparse 算法对优质序列进行OTU 聚类（Operational Taxonomic Units），序列相似性阈值为97 %。每个OUT 都有一个代表序列，将代表性序列与物种的使用RDP 数据库进行比对，设置70%的置信度阈值，对每个代表性序列进行物种注释。利用QIIME1（v1.8.0）软件进行α多样指数分析（包括Shannon、Simpson 和Chao1 等指数）。基于物种注释及相对丰度结果，使用R（v3.6.0）软件进行物种组成柱状图分析。

2 结果与分析

2.1 稀释性曲线

稀释性曲线可直接反映测序数据量的合理性，并间接反映样本物种丰富度。采用对序列进行随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们所能代表OTU 的数目构建稀释性曲线，当曲线趋向平坦时，说明测序数据量合理，更多的数据量只会产生少量新的OTU，反之则表明继续测序还可能产生较多新的OTU。因此，通过作稀释性曲线，可得出样品的测序深度情况。试验组与对照组大曲发酵样品的稀释性曲线见图1 和图2。由图1 和图2 可知，曲线最终趋势都趋于平坦，说明此次测序深度能反映样品中的物种信息。

图1 细菌稀释性曲线

图2 真菌稀释性曲线

2.2 Alpha多样性分析

通过Alpha 多样性分析可以知道微生物群落的丰富度和多样性。Chao1 指菌种丰富度指数，用以估计群落中的OTU 数目，通常Chao1 指数越高，样品中物种丰富度越大。Shannon（香农指数）是用来估算样品中微生物多样性指数之一，通常Shannon 指数值越大，表示样本中物种多样性越高，反之，样品中的物种多样性越低。由图3可知，随着大曲发酵的进行，试验组与对照组的细菌多样性均表现出逐渐增加的趋势，且在晾霉阶段与养曲阶段多样性变化幅度较大，出房曲的Chao1 指数与Shannon 指数均最高，说明出房曲的细菌丰富度和多样性最高。由图4 可知，随着大曲发酵的进行，试验组与对照组的真菌多样性均表现出先增加后降低的趋势，且在晾霉阶段的Chao1 指数与Shannon 指数最高，说明该阶段的真菌丰富度和多样性最高。

图3 细菌Alpha多样性box图

图4 真菌Alpha多样性box图

2.3 细菌群落多样性

基于属水平，试验组和对照组在大曲发酵过程中群落结构的演替情况见图5，相对丰度小于1 %的并为other。

由图5 可知，在细菌属水平上，上霉阶段试验组和对照组群落结构有所差异。试验组中，乳杆菌属（）占绝对优势，占83 %；对照组中，乳杆菌属（）占50.7 %、明串珠菌属（）占17.3 %、拟杆菌属（）占15.9 %、魏斯氏菌属（）占3.8 %、欧文氏菌属（）占3.5%。

图5 基于属水平细菌群落结构分布

在大曲发酵过程中，葡萄球菌属（）相对丰度逐渐增加，在大火阶段增加幅度较大，发酵后期趋于稳定，可能与发酵温度有关；乳杆菌属（）从大火阶段开始相对丰度减少；短杆菌属（）从大火阶段开始相对丰度增加；明串珠菌属（）在大曲发酵过程中一直存在，在大火阶段前相对丰度较高，在大火阶段后相对丰度较低；欧文氏菌属（）在大曲发酵过程中一直存在，在大火结束时丰度最高，试验组7.5%，对照组4.8%；醋酸杆菌属（）在发酵过程中先增加后降低，在潮火结束时丰度最高，试验组5.6 %，对照组3.4 %，大曲出房时，醋酸杆菌属相对丰度分别是试验组1.0%，对照组0.9 %；棒杆菌属（）在大曲发酵过程中相对丰度逐渐增加，出房曲相对丰度分别是试验组1.8%，对照组1.4%。葡萄球菌属（）为革兰氏阳性球菌，需氧或兼性厌氧，最适生长温度为37 ℃，多数葡萄球菌能分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产酸不产气；乳杆菌属（）为革兰氏阳性，不生孢，兼性厌氧，化能异养菌，需要营养丰富的培养基，发酵分解糖代谢，终产物中50 %以上是乳酸；短杆菌属（）是放线菌目中一属专性好氧、过氧化氢酶阳性、无芽孢的革兰氏阳性段杆状细菌；明串珠菌属属于乳酸菌，利用葡萄糖进行异型乳酸发酵产生D 型乳酸、乙酸或醋酸；欧文氏菌属（）属于好氧或者兼性厌氧发酵型革兰氏阴性杆菌，能分解果糖、半乳糖、D-葡萄糖和蔗糖产酸；醋酸杆菌属（）是一类能使糖类和酒精氧化成醋酸等产物的短杆菌，革兰氏阳性，极端严格好氧，因此，在大火期之后，醋酸杆菌属相对丰度降低。

出房曲样本中相对丰度含量较高的依次是葡萄球菌属（）、乳杆菌属（）、短杆菌属（）、一类未鉴定的属（undentified）、棒杆菌属（）、明串珠菌属（）、短状杆菌属（）。试验组和对照组的区别在于对照组中链霉菌属（）相对丰度较高，为4.4 %，试验组中链霉菌属相对丰度为0.8 %；对照组中欧文氏菌属（）相对丰度较高，为2.2 %，试验组相对丰度为0.7 %。链霉菌属在发酵前期含量不大，且试验组与对照组差异不大，从后火阶段开始，链霉菌属相对丰度逐渐增大，试验组和对照组之间差异逐渐增大。有研究表明，大曲中的链霉菌产生的土味素(geosmin，GsM)是造成白酒土霉味的主要原因。造成该差异的原因需要进一步探究。

2.4 真菌群落多样性

基于属水平，试验组和对照组在大曲发酵过程中群落结构的演替情况见图6，相对丰度小于1 %的并为other。

图6 基于属水平真菌群落结构分布

由图6 可知，在真菌属水平上，卧曲阶段试验组和对照组群落结构有所差异。试验组中，复膜孢酵母属（）相对丰度最高，为61.5 %，其次是一类未鉴定的属，相对丰度为33.5 %；对照组样本物种丰富度较高，相对丰度由高到低依次是根霉属（）28.0%、复膜孢酵母属（）21.4 %、嗜热子囊菌属（）14.5 %、12.1 %、毕赤酵母属（）7.4%、曲霉属（）3.4%。

发酵过程中，复膜孢酵母属（）相对丰度先增高后降低，之后趋于稳定，上霉阶段，复膜孢酵母属（）相对丰度最高；上霉结束后，复膜孢酵母属（）相对丰度逐渐减少，毕赤酵母属（）相对丰度逐渐增加；根霉属（）在发酵前期样品中丰度较高，后期逐渐较少；在大曲发酵过程中先增高后降低，在晾霉阶段相对丰度最高，分别是试验组6.5 %，对照组19.3 %。复膜孢酵母属属于酵母菌，能产淀粉酶、酸性蛋白酶、β-葡萄糖苷酶，且所产的酶都具有较高的活性，还具有一定的产香产酯能力，在酿酒工业中具有重要地位；毕赤酵母属是工业发酵中酿酒酵母的有益补充，广泛存在于发酵食物和水果中，能增加食品或饮料的风味，同时，具有多重耐受性和独特的碳氮代谢，在生物能源领域具有巨大潜力。

在真菌属水平上，出房曲样本中毕赤酵母属（）相对丰度最高，试验组64.6 %，对照组64.5 %；其次是复膜孢酵母属（），试验组29.4%，对照组28.1%。试验组和对照组之间无显著性差异。

3 结论

采用Illumina Miseq 高通量测序技术对不同大麦品种培曲过程中细菌和真菌群落结构变化规律进行了分析。

从细菌群落结构分析来看，随着大曲发酵的进行，试验组与对照组的细菌多样性均表现出逐渐增加的趋势，且在晾霉阶段与养曲阶段多样性变化幅度较大，出房曲的细菌丰富度和多样性最高。虽然上霉阶段二者的细菌多样性有所差异，但是随着发酵的进行，二者群落结构逐渐趋于相似。在细菌属水平上，上霉阶段试验组和对照组群落结构有所差异，对照组细菌多样性较高。在发酵过程中，细菌多样性呈逐渐增加的趋势，试验组和对照组出房曲样本中相对丰度含量较高的依次是葡萄球菌属（）、乳杆菌属（）、短杆菌属（）、棒杆菌属（）和一类未能鉴别的属等。试验组和对照组的区别在于对照组中链霉菌属（）相对丰度较高，为4.4 %，试验组中链霉菌属相对丰度为0.8%。造成该差异的原因需要进一步探究。

从真菌群落结构分析来看，随着大曲发酵的进行，试验组与对照组的真菌多样性均表现出先增加后降低的趋势，且在晾霉阶段的Chao1 指数与Shannon 指数最高，说明该阶段的真菌丰富度和多样性最高。虽然卧曲阶段二者的真菌多样性有所差异，但是随着发酵的进行，二者群落结构逐渐趋于相似。在真菌属水平上，卧曲阶段试验组和对照组群落结构有所差异，对照组样本物种多样性较高。在真菌属水平上，出房曲样本中毕赤酵母属（）相对丰度最高，试验组64.6 %，对照组64.5 %；其次是复膜孢酵母属（），试验组29.4%，对照组28.1%。试验组和对照组之间无显著性差异。

研究结果表明，大曲发酵的细菌群落变化的关键转折点是大火阶段，菌群结构发生了较大的变化。乳杆菌属相对丰度大幅减少，葡萄球菌属相对丰度大幅增加；欧文氏菌属、醋酸杆菌属在大火阶段相对丰度最高，大火阶段之后逐渐减少；短杆菌属从大火阶段开始，相对丰度逐渐增加。原因可能是大火阶段温度较高，且随着发酵的进行，曲块逐渐由有氧环境变为无氧环境，造成了好氧菌相对丰度的降低，厌氧菌相对丰度的增加。随着大曲发酵的进行，从大火阶段开始，大曲真菌群落结构趋于稳定，且上霉的主要真菌属是复膜孢酵母属。虽然试验组与对照组在卧曲阶段细菌与真菌群落结构差异较大，但是随着大曲发酵的进行，二者的细菌与真菌群落结构逐渐趋于一致，大曲出房时，试验组与对照组之间无显著差异。由此表明，在大曲发酵过程中，发酵环境对大曲发酵的影响大于原料中的微生物。