洋河浓香型大曲产香细菌的筛选、鉴定及香气成分分析

陈桂芳，王晓慧，赵 琦，邵高超，董大伟

（江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁 223800）

白酒是我国民族传统产品，历史悠久、风格独特，白酒的质量决定了一个企业的竞争力与生命力。洋河浓香型大曲由于其特殊的制曲工艺，网罗了许多产香微生物，形成了特定的微生物区系，这些产香微生物对白酒风味的形成起着至关重要的作用。随着研究的深入，浓香型大曲产香功能菌在提高白酒的品质、丰富白酒风味等方面取得了较好的应用效果。本研究从浓香型大曲中分离筛选产香细菌，对筛选得到的菌株进行高通量测序鉴定和产香性能研究，在探索不同微生物产香特性的同时，以期筛选出呈香效果较好的微生物种属，为洋河浓香型大曲质量的提升和制曲机理的研究提供一定的理论依据和实践基础。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器

1.1.1 大曲样品

选取洋河酒厂制曲一、二车间的出房曲，从感官、微生物和理化指标等维度进行综合评价，选取综合质量较好的优等大曲作为筛选样本，粉碎后过40 目筛，采用四分法缩至200 g，装于无菌袋，4 ℃冰箱保存备用。

1.1.2 试验耗材

细菌分离、保藏培养基：LB培养基。

细菌种子培养基：LB肉汤。

小麦固体培养基：取200 g 适度粉碎的小麦于500 mL 三角瓶中，调节小麦原料含水量36 %～38.5%。

1.1.3 仪器设备

分析天平（±0.0002 g），型号AR224CN，上海奥豪斯公司；电热恒温水浴锅（±0.1 ℃），型号DKS24，上海苏达实验仪器有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅（±0.1 ℃），型号LDZW-80KCS，上海申安医疗器械厂；电热恒温培养箱（±0.1 ℃），型号DNP-9162，上海精宏实验设备有限公司；SW-CJ-1F 超净工作台，苏州苏洁净化设备有限公司；烧杯；三角瓶；发酵栓；培养皿等。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌的分离、纯化

采用稀释涂布平板法对细菌进行分离筛选：准确称取2 g 大曲样品，置入装有18 mL 无菌水的三角瓶中，振荡30 min。用移液枪吸取1 mL 振荡均匀的菌悬液，置入装有9 mL 无菌水的试管中，振荡均匀，以此10倍逐级稀释至10。

取10、10、103 个稀释度的菌悬液分别在LB 培养基上进行平板涂布，于37 ℃下倒置培养24 h。长出菌落后，选取具有典型细菌特征的菌落进行划线分离、纯化，镜检后编号，接种于斜面试管中保藏，并送至上海美吉生物医药科技有限公司进行菌株鉴定。

1.2.2 固态产香实验

将分离出的细菌菌株分别接入LB肉汤中，37 ℃摇床培养16 h 后，调节种子液浓度至10个/mL。按10%接种量接种于灭菌后的小麦固体培养基中，于37 ℃静置培养9 d。

1.2.3 产香性能测定

对各细菌菌株的发酵产物进行感官评价。对发酵产物香味良好的菌株进行挥发性成分的鉴定分析。

1.2.3.1 固态发酵产物感官评价

由6 名闻香专业人员组成评价小组，对各菌株发酵后的样品进行外观、香味评价。

1.2.3.2 固态发酵产物的挥发性成分检测

根据参考文献修改。

固相微萃取条件：取3 g 发酵产物于顶空瓶中，放入40 ℃左右的孵化池，再加入乙酸薄荷酯内标20 μL（100 mg/L）；60 ℃顶空瓶中预热10 min 后插入固相萃取头吸附40 min，萃取结束后立即插入气相色谱-质谱联用仪进样口热解吸5 min。

色谱条件：HP-FFAP 石英毛细管柱（50 m×0.20 mm×0.33 μm）；升温条件：柱温箱温度50 ℃保持3 min，以3 ℃/min 升温至170 ℃，再以6 ℃/min升温至230 ℃保持5 min，总检测时间50 min；载气流速1.5 mL/min；分流比设为不分流；质量扫描范围30～550 amu，检索NIST 库，选取匹配度大于800 的物质，采用内标法计算化合物的含量。

2 结果与分析

2.1 大曲样本的筛选

从制曲车间选取3 种感官较好且微生物和理化指标适中的大曲进行粉碎并混合后作为筛选样本。大曲的感官和理化指标结果见表1。选取的大曲筛选样本感官方面包含了断面发酵好、火圈匀净和菌丝饱满等特征，理化指标均在优等曲指标范围，富含霉菌、酵母和细菌等功能菌。

表1 中高温大曲的感官及理化指标

2.2 产香微生物的筛选及鉴定

挑取不同形态特征的菌落进行划线，分离单菌落，记录单菌落的特征，并对分离菌株鉴定结果进行汇总，结果见表2。结果表明，本次筛选出共计8株菌株，均为芽孢杆菌属，经高通量测序分析，分别为贝莱斯芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、空气芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌、短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。其中贝莱斯芽孢杆菌的菌落特征主要表现为圆形，菌落较大，有凸起，无光泽，边缘不整齐；地衣芽孢杆菌的菌落特征表现为不规则圆形，边缘规则，透明有光泽；枯草芽孢杆菌在菌落形态上表现为圆形或不规则圆形，菌落大小适中，没有光泽，边缘呈绒毛状；其余芽孢杆菌多表现为菌落呈微黄、黄色或乳黄色，菌落较小，边缘较整齐，表面湿润有光泽。

表2 产香芽孢杆菌菌落形态及鉴定结果

2.3 产香微生物的产香验证实验

8 株芽孢杆菌的产香试验结果如表3 所示。结果表明，地衣芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌、短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌在模拟发酵过程中产生明显的褐变反应。褐变反应与形成酱香型酒的风格质量有着十分密切的联系，是产生酱香物质的基础，因此褐变反应控制得当，可以赋予大曲独特的风味。褐变反应的菌株产香效果中多含有酱香味；没有发生褐变反应的菌株产香效果较差，多为霉味、馊味、汗臭味、氨味等异杂味。

表3 8株芽孢杆菌产香试验结果

贝莱斯芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、空气芽孢杆菌整体产香效果较差，主要以异杂味为主，且褐变反应不突出；地衣芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌和短芽孢杆菌虽产酱香明显，但含有酸味、臭味等异杂味；枯草芽孢杆菌呈香效果最好，以甜酱香为主且香气浓郁，是本次筛选中最理想的产香细菌。

2.4 产香微生物的香气成分分析

对菌株X-8 的发酵产物进行感官跟踪，发现随着发酵时间的延长，发酵基质在外观上从小麦原色至深褐色，气味从小麦原味到香味微弱、有酱味，最终呈现浓郁的香味，这一现象与明红梅等的研究结果相一致。菌株X-8 的发酵产物的香气成分分析见表4 和表5，发酵产物中的香气成分共有65种，主要为吡嗪类、醇类和酮类，其中吡嗪类物质的相对含量最高，达60.8 %，其次为醇类，达21.4 %，酸类和酯类物质较少，不产生醛类和胺类物质。吡嗪类物质具有焙烤香、咖啡和烤面包香，在大曲香味中贡献较高；醇类物质中的2,3-丁二醇主要产生似黄油、乳脂、水果香，是酒类中极少数呈香的多元醇。发酵产物中含有的2-甲氧基-苯酚、2-羟基-3-己酮、2-庚酮等也是大曲和白酒的主要香味成分。因此，枯草芽孢杆菌X-8 是浓香型大曲中1株较为理想的产香功能细菌。

表4 X-8发酵产物挥发性物质汇总表

表5 X-8发酵产物挥发性物质测定

3 结论

通过稀释涂布平板法及高通量测序成功筛选到一株产香效果较好的枯草芽孢杆菌X-8。通过单菌株产香试验感官闻香，发现X-8 香味特征表现为浓郁的甜酱香味。利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对该菌株发酵后的香气成分进行分析，发现该菌株发酵产物中共有65 种香气成分，主要为吡嗪类和醇类，这两类物质也是浓香型大曲及白酒的重要香味成分。因此，枯草芽孢杆菌X-8是浓香型大曲中一株较为理想的产香功能细菌。