水解度对山药可溶性蛋白酶解物功能特性的影响

王艳红，李贝贝，李 欣，赵 勇，王风琴，谢朝晖

(1.河南城建学院 生命科学与工程学院，河南 平顶山 467036;2.平顶山健康食品协同创新中心，河南 平顶山 467036)

山药(Dioscoreaopposita)为一年或多年生蔓生草本植物，是薯蓣科薯蓣属植物，具有药食兼用的特点[1]。山药作为一种食用和保健价值很高的天然食品资源，在亚洲、非洲和南非均有种植，在我国陕西、河南等省份种植比较广泛。近年来，在科技强农和脱贫致富政策的带动下，我国其他地区也开始了大面积种植[2]。通常山药(干重)中淀粉含量为75%～84%，粗蛋白含量为6%～8%，粗纤维含量为1.2%～1.8%；山药块茎中含有薯蓣皂苷元、尿囊素、胆碱和蛋白质等功能成分[3]。薯蓣皂苷元是薯蓣的主要贮藏蛋白，占薯蓣可溶性蛋白总量的80%～85%。近二十年来，许多研究表明，薯蓣皂苷在体内外均具有酶活性、抗氧化活性、抗高血压活性、免疫调节活性、凝集素活性和气道上皮细胞保护活性[4]。因此，对山药营养成分的研究在实际应用中具有重要的参考价值。

随着人们对食品和保健品需求的增加，对蛋白质的需求也进一步增加。植物蛋白来源广泛，成本低廉，并且拥有与动物蛋白相类似的营养组成，所以开发和利用植物蛋白资源显得尤为重要，这也成为今后研究开发植物蛋白的热点[5]。山药可溶性蛋白质(Yam soluble protein,YSP)中含有人体生命活动所必需的氨基酸，其中谷氨酸和天冬氨酸居多，其他8种必需氨基酸约占YSP的33.7%，且YSP中某些必需氨基酸或氨基酸对的含量高于FAO与WHO所描述的“理想蛋白质”的标准[6]。亚洲山药资源丰富，种植及食用人群较多，加快对山药可溶性蛋白的研究显得尤为重要。

研究显示，山药可溶性蛋白(YSP)可参与多种生理活动，如清除自由基、免疫活化和抗高血压等[7]。另外，蛋白质作为食品中重要的营养成分，其功能特性是其他食品成分不能替代的，对食品的品质具有决定性作用[8]。而一定程度的酶解可以改变蛋白分子的大小、构象及分子间/内相互作用力，从而增强其功能特性，但过度的酶解可能造成其功能特性的部分丧失，因此控制蛋白酶解程度对于获得具有良好功能特性的蛋白制品是必不可少的[9]。然而，关于YSP功能特性的信息很少被报道，这可能影响其在食品系统中的效用。本文采用碱溶酸沉法提取山药可溶性蛋白，探讨不同水解度下YSP功能特性，如持水性和持油性、乳化性及乳化稳定性、起泡性及起泡稳定性的变化趋势，研究结果可为山药可溶性蛋白在食品或保健品及其他行业的应用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山药可溶性蛋白：实验室制得；碱性蛋白酶(酶活200 u/mg)购于合肥博美生物有限公司；氢氧化钠、磷酸二氢钾、亚硝酸钠等均为国产分析纯。

JJ100超微量电子天平；SW-CJ-2F恒温水浴锅；721系列紫外分光光度计；GENIUS 16K低速离心机；Scientz-12N冷冻干燥机；MYP11-2磁力搅拌器；FW100高速万能粉碎机；FR-1210干燥箱；VORTEX-GENIE2涡旋振荡器。

1.2 实验方法

1.2.1 山药可溶性蛋白的提取

1.2.2 蛋白质含量测定

(1)绘制蛋白质标准曲线：以牛血清白蛋白为标准样品，采用考马斯亮蓝法测定其含量，以吸光度(A)为横坐标，蛋白质浓度(μg/mL)为纵坐标，绘制标准曲线[10]。

(2)蛋白质含量测定：取1 mL的提取液于试管中，加5.0 mL考马斯亮蓝溶液后摇匀，在595 nm的波长下测定吸光度。与标准曲线对比，计算蛋白质含量[11]。

1.2.3 不同水解度山药蛋白酶解液的制备[12]

将一定量YSP，按底物质量浓度为1 mg/ml添加蒸馏水，搅拌至底物均匀分散于水中，调节pH至9±0.5，50 ℃水浴加热，按201的质量比添加碱性蛋白酶，反应过程中及时加入0.1 mol/L的NaOH，使系统保持在pH为9，分别酶解30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360 min，酶解结束后把酶解液放入100 ℃的沸水中灭酶5 min，待溶液冷却后调pH至中性，离心(4500 r/min，5 min)后去上清液即为山药蛋白酶解液。

1.2.4 山药蛋白水解度的测定

YSP水解度的测定方法采用pH-Stat法[13]，此方法的依据是测定整个水解过程中维持体系pH到9所消耗的0.1 mol/L的氢氧化钠溶液的总体积，代入水解度测定公式，计算可得到YSP的水解度。水解度的计算公式为：

DH/%=(B×Nb)/(a×Mp×htot)×100%

(1)

式中：B为整个水解过程 NaOH 溶液的消耗量(mL)；Nb为滴定的NaOH溶液浓度(mol/L)；Mp为酶解的山药蛋白质量(g)；htot为山药蛋白中肽键的总数，取值8.2 mmol/g；α为蛋白氨基的平均解离度α=(10pH-pK)/(1+10pH-pK)，pk为7.0，得α为0.99。

1.2.5 山药可溶性蛋白持水性和持油性的测定[14]

量取20 mL酶解液置于烧杯，加入10 mL水或花生油，充分震荡后，将溶液磁力搅拌30 min后离心(4 500 r/min,30 min)，弃去水或花生油，称量离心后沉淀的质量，按式(2)计算持水性(WHC)或持油性(OHC)。

WHC/OHC=(M2-M1)/M

(2)

式中：M为样品质量(g)；M1为离心管和沉淀物的总质量(g)；M2为离心管和样品的总质量(g)。

1.2.6 山药可溶性蛋白乳化性和乳化稳定性的测定[15]

YSP乳化性的测定：取5 mL酶解液至烧杯中，加入10 mL蒸馏水和10 mL花生油，放入离心管中，在涡旋振荡器下振荡匀质5 min后，以1 500 r/min离心15 min，离心后测量出离心管中乳化层的高度记为N1，液体层的高度记为K，按式(3)计算乳化性(EAI)。

EAI=N1/K×100%

(3)

YSP乳化稳定性的测定：把离心管放入90 ℃恒温水浴锅，静置30 min，待冷却后离心(1 500 r/min,15 min),测量出离心管中乳化层的高度记为N2。按公式(4)计算乳化稳定性(ESI)。

ESI=N2/N1×100%

(4)

1.2.7 山药可溶性蛋白起泡性和起泡稳定性的测定[16]

用量筒量20 ml酶解液，再倒入100 mL蒸馏水，用涡旋振荡器振荡匀质5 min，记录均质停止时泡沫的体积，按式(5)计算起泡性。

(5)

式中：V0为均质停止后的泡沫体积(ml)。

将均质的样品静止放置20 min后，观察记录泡沫体积，反复重复3次，取平均值。按公式(6)计算起泡稳定性。

(6)

式中：V0为初始泡沫体积(ml),V20为静置20 min后泡沫体积(ml)。

1.3 数据统计及分析

采用Excel 2007软件进行数据分析处理，GraphPad Prism 5软件进行数据分析并作图。

2 结果与分析

2.1 山药可溶性蛋白浓度的测定

蛋白质浓度标准曲线如图1所示。

建立标准曲线方程：Y=0.005 6X+0.130 5(R2=0.998 2)，由标准曲线方程测得的YSP的含量为353.27 mg/g。

2.2 水解度的测定

山药可溶性蛋白水解度与水解时间的关系如图2所示(图中误差线均表示标准误差)。

图1 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度标准曲线

图2 YSP水解度曲线

由图2可知，运用 pH-STAT 法测定山药可溶性蛋白的水解度，在1～6 h时间段内YSP的水解度随水解时间的增加呈先上升后平缓趋势，在30～60 min水解度增加较为明显，随时间延长，水解度增长速度变缓，这可能与碱性蛋白酶为专一性较强的酶有关，随着水解时间的延长，底物蛋白中作用的肽键位点会越来越少，导致水解速度越来越慢[17]。当水解时间为300 min时，水解度达到最高为28.12%，随着水解时间的继续延长，蛋白水解度变化不明显。根据此结果，选取6个梯度60、120、180、240、300、360 min进行功能性质的测定。

2.3 持水性和持油性的测定

不同水解度山药可溶性蛋白的持水性和持油性如图3、图4所示。

图3 水解时间对YSP持水性的影响

图4 水解时间对YSP持油性的影响

持水性和持油性对食品的质地特性影响比较大，如多汁性、口感和嫩度，一般可作为肉类蛋白的替代品[18]。由图3可知，酶解时间60～300 min时，YSP的持水性呈现增加趋势，当水解时间为300 min时，YSP持水性最佳。这是由于存在高浓度的极性基团，导致样品中极性基团的蛋白质-水相互作用和疏水性的产生[18]。水解时间超过300 min，持水性反而会下降。这可能是因为样品中疏水性基团较高引起的。

持油性是指蛋白质通过与油的疏水作用结合而保留的油量。由图4可知，YSP的持油性随着酶解时间的增加而呈现整体增强趋势。持油性的提高可能是酶解后蛋白质空间结构打开，暴露了疏水基团，因此截留更多的油[19]。

2.4 乳化性及乳化稳定性的测定

不同水解度山药可溶性蛋白的乳化性及乳化稳定性如图5所示。

蛋白质作为一种表面活性剂，可降低水或油的表面张力，从而产生乳化现象；同时，蛋白质可分散在连续相和非连续相之间的界面上，阻止非连续相的聚集，达到乳化稳定性的结果[20]。由图5可知，水解60～360 min，随着时间的增加，乳化性先上升后趋于稳定但并没有明显下降。分析可能原因是，经碱性蛋白酶酶解后，YSP的分子水解变小，多肽链上暴露的部分疏水基团吸收油脂的能力增加，使得溶液中的多肽小分子迅速移动到油层和水层的分界面上，形成了乳浊体使得蛋白酶解液的乳化性增强[18]。随着水解时间的延长及水解度的增强，乳化性没有明显变化，可能此时多肽结合油脂的能力与其溶解性的增加有关，因为蛋白质溶解度的增加降低了多肽分子向油水界面转移的速度，从而影响了蛋白酶解物的乳化活性[21]。但具体原因还有待进一步分析。

乳化稳定性结果显示，随着水解时间的增加，乳化稳定性也呈增加趋势。在水解60～300 min时间段内乳化稳定性的增加较为明显，可能因为这段时间油脂分子形成的屏障使得乳化稳定性上升较快，另外，多肽中疏水基团对油脂具有保护作用，此时乳化稳定性会随着蛋白水解度的升高而升高。

2.5 起泡性及起泡稳定性的测定

不同水解度山药可溶性蛋白的起泡性及起泡稳定性如图6所示。

图5 不同水解度对YSP乳化性及乳化稳定的影响

图6 不同水解度对YSP起泡性及起泡稳定性的影响

具有良好起泡性的蛋白质可以帮助食品形成稳定的气泡，即形成疏松多孔的结构，一般可用于烘烤食品中。由图6可知，起泡性随着水解时间的增加而增加，在水解时间为360 min时YSP酶解液的起泡性最大达50%左右。原因可能是由于蛋白质上的净电荷增加，从而减弱了疏水相互作用，增加了蛋白质的灵活性[22]。

YSP酶解液的起泡稳定性随着酶解时间的增加而呈现整体下降趋势，起泡稳定性下降的原因可能是酶解液里的多肽黏度下降，使其形成的液膜强度降低，从而形成的泡沫稳定性较差，容易消散[22]。起泡稳定性在酶解时间60 min时达到最大值63%，较为稳定。

3 结论

将YSP用碱性蛋白酶水解，通过控制酶解时间得到不同水解度的YSP。研究YSP在不同水解度下功能特性的变化趋势发现，水解度可增强也可以削弱某些功能特性。在酶解60～ 360 min内，YSP酶解物的持水性随酶解时间的增加先上升后下降，持油性和起泡性随酶解时间的增加而增强，山药蛋白的乳化性和乳化稳定性随着酶解时间的增加先上升后趋于稳定，而起泡稳定性随着酶解时间的增加呈下降趋势。在实际应用中应根据具体情况合理选择适度水解条件下的山药多肽。该研究结果可为山药可溶性蛋白的深加工应用提供一定的理论参考依据。