3种橐吾属植物提取物的杀虫抑菌活性

李 晶，李 娜，丁 品，付麟雲，王 涛，杜文静，张建军，武建荣，刘锦霞

（1. 甘肃省科学院生物研究所, 甘肃 兰州 730000；2. 甘肃省医学科学研究院, 甘肃 兰州 730000）

黄帚橐吾(Ligularia virgaurea)、箭叶橐吾(L.sagitta)和藏橐吾(L. rumicifolia)同属于菊科橐吾属(Ligularia)植物，主要分布于青藏高原东北部、云南西北部、甘肃、青海、四川等高海拔地区的草地、湿地、沼泽、草甸及灌丛中，是甘肃省甘南地区草地中的优势毒杂草，现已成为甘南草地退化的标志之一[1]。目前，对于草原毒杂草的综合治理成为当地生态环境保护、草地修复的重中之重。有研究表明化学除草剂可清除黄帚橐吾等毒杂草，但同时会威胁其他牧草的安全，在植物生长、生物多样性等方面对牧草造成药害[2]，且化学药剂的大量施用，会导致农药成份残留、累积[3]，对牧场动、植物和整个草地生态系统产生潜在威胁。

近年来，开发黄帚橐吾等草原毒杂草综合利用价值的研究越来越多[1,4-9]，这不仅为生物农药研发拓展了新的资源，也从“变害为利”的角度为草原毒杂草的治理提供了新思路。随着人民生活水平的提高，减少使用化学农药的需求日益显现，而植物源农药“取之于自然，用之于自然”。植物体内会产生参与自身防御的次生代谢产物，利用这些产物不利于有害生物的特性可开发成为植物源农药[10]，因其具有天然、有效、安全、环保无污染等特性，成为替代化学农药，实现绿色可持续发展农业的有效手段之一。已有研究表明：紫茎泽兰(Ageratina adenophora)精油中所含的单萜烯粒和含氧单萜类化合物, 对玉米象(Sitophilus zeamais)、米象(Sitophilus oryzae)、蚕豆象(Bruchus rufimanus)、绿豆象(Callosobruchuschinensis) 4种仓库害虫具有很强的熏杀活性[4]；瑞香狼毒(Stellera chamaejasme)根乙醇提取物对云纹粉蝶(Appias indra)幼虫、榆白长翅卷蛾(Acleris ulmicola)幼虫有较强的触杀活性[5]；白喉乌头(Aconitum leucostomum)总生物碱提取物能抑制植物病原菌菌丝的生长，且能触杀棉蚜(Aphis gossypii)[6]。黄帚橐吾茎叶甲醇提取物对菜粉蝶(Pieris rapae)幼虫有较强的拒食和触杀作用[7]，对水稻纹枯病菌和玉米大斑病菌也有较强的抑制作用[8]。黄帚橐吾乙醇提取物对保护地辣椒(Capsicum annuum) 4种常见的真菌性病原菌及其所致病害有较好的抑菌及防治效果，防效可达75%以上[9]；对棉铃虫(Helicoverpa armigera)有很强的农药生物活性，主要表现为对受试害虫较强的胃毒和拒食作用[1]。根据连续几年的实地调查，箭叶橐吾和藏橐吾的数量在草场毒杂草中所占的比例均逐年增多，但对于这两种植物的农药活性研究还未见报道。

玉米(Zea mays)是甘肃省主要种植的农作物之一，而玉米粘虫(Mythimna separata)是危害玉米产量的主要害虫，能造成受侵害玉米地大面积减产甚至绝收[11]。同时，甘肃省也是高原夏菜的主产区，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)寄主范围十分广泛，不仅是辣椒枯萎病的病原菌[12]，还可引起茄科、豆科和十字花科等100多种植物相应病害的发生[13]，造成较大经济损失。针对上述情况，本研究将以上两种病虫害作为受试体，以黄帚橐吾、箭叶橐吾和藏橐吾3种甘南草场中常见的毒杂草为研究对象，测定和对比其提取物对粘虫幼虫和尖孢镰刀菌的农药生物活性，为植物源生物农药的研发开拓资源、奠定基础，也为草原有害毒杂草的综合治理提供新的途径。

1 材料和方法

1.1 材料

提取物制备及药液配制：7月 - 8月收集黄帚橐吾、箭叶橐吾和藏橐吾地上部分植株，阴干、粉碎机粉碎。采用冷浸法进行提取：将植株干材料与90%乙醇按照体积比1 : 10混匀浸泡，每12 h翻搅混匀一次，浸泡72 h后，将浸出液用16层纱布滤出。如此反复3次。浸出液经两层中速滤纸抽滤后减压蒸馏，条件为30～35 ℃、0.075～0.080 MPa，得到褐色或褐绿色有特异气味的浸膏。配制试验用药时，将吐温-80作为助溶剂，与浸膏按照0.1 mL·g-1的比例混匀，再用水配制成所需浓度，对照为吐温-80水溶液，浓度相当于最高浓度药液所加量。

受试害虫：粘虫卵购自北京绽诺思特生物科技有限公司，经26～28 ℃孵化，玉米嫩叶饲养。以带药叶片喂食试虫前，先进行12 h饥饿处理。

受试病原菌：尖孢镰刀菌是辣椒枯萎病的病原菌，为甘肃省科学院生物研究所农业生物技术研究室从相应的发病植株上采集、分离、鉴定和保存的。

1.2 试验方法

1.2.1胃毒活性测定

采用叶片载毒法[14]对粘虫进行胃毒活性的测定。选取直径1.0 cm的无毒玉米叶片，用1.00 μL的微量点样器在每一片叶上点涂0.50 μL的药液，点涂丙酮作为对照，置于通风处挥发掉溶剂后放入培养皿中(皿底铺保湿滤纸，防止叶片干缩)，接入3 龄饥饿处理后的幼虫，每头试虫给予一片载毒叶片。每组处理15头试虫，3 次重复。24 h后取出载毒叶片，以新鲜叶片喂食。每天定时观察、记录，连续7 d。计算死亡率和校正死亡率。

1.2.2触杀活性测定

采用点滴法[15]对粘虫进行触杀活性的测定。用微量点样器将药液点滴在试虫的前胸背板，每头0.50 μL，每皿15头试虫，3 次重复，丙酮作为对照，以新鲜玉米叶片喂食。于24 h后记录死亡虫数、中毒症状，计算死亡率、校正死亡率。

1.2.3拒食活性测定

采用叶蝶法[15]对粘虫进行拒食活性的测定。挑选直径为1.0 cm新鲜玉米叶放入待测药液中浸渍5 s取出, 对照组叶片以丙酮作相同处理。置于通风处待丙酮自然挥发后，取处理和对照叶碟各一片平行放置于直径5 cm的培养皿中，皿底内垫保湿滤纸，每皿接入1 头饥饿处理后的3 龄粘虫幼虫，每处理15 头试虫，重复3 次。24 h 后取出残存叶片，用坐标方格纸法测定取食面积，并据此计算试虫拒食率。

式中：SCK、S分别表示对照和处理组的取食面积。

1.2.4室内毒力测定

采用浸叶法对粘虫进行室内毒力的测定。选取宽度、叶色等指标基本一致的玉米叶片洗净晾干后制成长约1 cm的叶碟，浸入已配置好的不同浓度药液中5 s，取出晾干，每个铺有潮湿滤纸的培养皿中放置一片叶碟。选取大小及活力基本一致、且经饥饿处理的3龄粘虫幼虫各15头，接在相同浓度药液处理的叶碟上，每组处理重复3次。对照组喂食新鲜叶片。48 h后调查死亡虫数，计算LC50值、相关系数及毒力回归方程。

平心而论，“苛人宽己”是多数平凡人在生活中的常态。然而，遇到问题时，“修身自省”才是处理好事情的关键所在。

1.2.5影响真菌病害病原菌菌丝生长活性的测定

采用菌丝生长速率法[16]。取一定量植物提取物，加入到经过121 ℃、25 min高温灭菌的PDA培养基(马铃薯培养基)中，使其成为含药量为20、40、60、80、100 mg·mL-1的混合培养基。将此培养基倒入直径90 mm的培养皿中制成含3种植物不同浓度提取物的平板。无菌条件下，用已灭菌的打孔器在尖孢镰刀菌活化平板近边缘处取直径0.5 cm的菌丝块，接种于含药平板上，菌丝朝下，对照组为PDA培养基，26 ℃恒温培养5 d，用十字交叉法测量菌落直径。每组处理重复3次。计算菌丝生长抑制率(MGI)。

式中：dc表示对照组菌丝平均生长直径；dt表示处理组菌丝平均生长直径。

1.2.6数据处理

所测数据采用SPSS 22.0软件进行统计分析，测定结果采用“平均值 ± 标准误”表示，用One-Way ANOVA中的Duncan法对同一植物提取物不同浓度间的数据进行单因素方差分析以及多重比较，用Regression中的Probit计算LC50值；采用Excel 2019制图。

2 结果与分析

2.1 提取物对粘虫幼虫的胃毒活性

3种橐吾属植物的提取物均对粘虫3龄幼虫表现出不同程度的胃毒活性(表1)，藏橐吾提取物对粘虫幼虫的胃毒作用最强，提取物浓度在5 mg·mL-1时，粘虫幼虫的7 d累计校正死亡率均达到70.00%。黄帚橐吾提取物对粘虫幼虫有较强的胃毒活性，当提取物浓度为20和10 mg·mL-1时，粘虫幼虫的7 d累计校正死亡率分别为97.62%和75.00%。箭叶橐吾提取物也对粘虫幼虫有一定程度的胃毒活性，当提取物浓度为20和10 mg·mL-1时，粘虫幼虫的7 d累计校正死亡率仅分别为47.62%和41.43%，与其他浓度处理组之间差异极显著(P＜ 0.01)。3种植物提取物对粘虫的胃毒LC50也显示出藏橐吾提取物对粘虫的胃毒活性最强，为1.24 mg·mL-1，黄帚橐吾提取物和箭叶橐吾提取物对粘虫的胃毒LC50分别为2.32 和30.94 mg·mL-1。

表1 3种橐吾属植物提取物对粘虫幼虫的胃毒活性Table 1 Stomach toxic activity of the extracts from three species of Ligularia against Mythimna separata

2.2 提取物对粘虫幼虫的触杀活性

随着3种橐吾属植物提取物浓度的升高，粘虫的累计死亡率也随之升高(表2)。藏橐吾提取物对3龄粘虫的触杀活性较强，浓度在10 mg·mL-1以上时，粘虫的累计校正死亡率均在79%以上，且与其他低浓度处理组之间差异极显著(P＜ 0.01)；当浓度为20 mg·mL-1时，粘虫的校正死亡率达90.47%。黄帚橐吾提取物浓度为20 mg·mL-1时，粘虫校正死亡率达到87.76%，与其他处理组相比表现出极显著差异(P＜ 0.01)。与其他两种橐吾属植物相较，箭叶橐吾提取物处理组的粘虫的死亡率和粘虫的触杀活性略低。3种植物提取物对粘虫的触杀LC50显示：藏槖吾提取物的触杀毒性略强于黄帚橐吾提取物，两者的LC50分别为3.52和5.84 mg·mL-1，箭叶槖吾提取物的触杀LC50为25.60 mg·mL-1，触杀毒性最弱。

表2 3种橐吾属植物提取物对粘虫幼虫的触杀活性Table 2 Contact toxicity of the extracts from three species of Ligularia against Mythimna separata

2.3 提取物对粘虫幼虫的拒食活性

粘虫幼虫对3种橐吾属植物的提取物均表现出较强的拒食活性(表3)，试虫在用药24 h内表现出明显的拒食行为。提取物浓度高于2.5 mg·mL-1时，3种槖吾属植物提取物对粘虫幼虫的拒食率均大于60%。当提取物浓度高时(≥10 mg·mL-1)，试虫几乎不再进食，试虫拒食率极显著(P＜ 0.01)高于低浓度处理组(＜ 10 mg·mL-1)，同时高浓度处理组取食面积均等于或低于0.04 cm2，低浓度处理组取食面积均等于或大于0.15 cm2，差别甚大。

表3 3种橐吾属植物提取物对粘虫幼虫的拒食活性Table 3 Antifeedant activity of the extracts from three species of Ligularia against Mythimna separata

2.4 提取物对粘虫幼虫的毒力比较

随着浓度升高，3种橐吾属植物提取物对粘虫幼虫的毒力呈上升趋势(图1)。3种植物中藏橐吾提取物的毒力较强，其浓度在2.5 mg·mL-1以上时，试虫的校正死亡率均在60%以上。黄帚橐吾提取物浓度为20 mg·mL-1时，试虫的死亡率与藏橐吾提取物相应浓度处理组的死亡率基本相同，其余浓度处理组的试虫死亡率均在40%以上。箭叶橐吾提取物的毒力相对较弱。分析显示，藏橐吾提取物的LC50为1.067 mg·mL-1，黄帚橐吾提取物的LC50为1.851 mg·mL-1，箭叶橐吾提取物的LC50为27.957 mg·mL-1。

图1 3种橐吾属植物提取物对粘虫幼虫的毒力Figure 1 The toxicity of extracts from three species of Ligularia against Mythimna separata

2.5 提取物对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制

3种提取物对尖孢镰刀菌的菌丝生长都具有极显著的抑制作用，且抑制程度随着提取物浓度升高而上升(图2)。3种橐吾属植物提取物抑制菌丝生长的能力与其杀虫效力类似，也表现为藏橐吾 ＞ 黄帚橐吾 ＞ 箭叶橐吾。

图2 3种橐吾属植物提取物对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制Figure 2 The inhibition activity of extracts from three species of Ligularia against mycelial growth of F. oxysporum

3 讨论

黄帚橐吾、箭叶橐吾和藏橐吾广泛存在于甘南的退化草地中[17-19]，已成为当地草地退化的标志之一[20]。本研究以综合开发利用的角度，从毒杀农业害虫和抑制植物病原菌两个方面，对这3种植物提取物的生物农药活性进行了测定，结果表明上述3种植物具有较大的生物农药开发潜力。

3种橐吾属植物提取物对玉米粘虫的毒杀作用方式基本一致，最强的作用方式是胃毒和拒食活性，触杀活性也较强，该结果与刘锦霞等[1]的研究结果一致。此结果表明后续开发上述3种橐吾属植物提取物为主要原料的生物农药时，应充分考虑制剂的吸附性和渗透性[21]，一方面制剂应能较长时间吸附在植物表面，以便能充分发挥农药对目标害虫的拒食及胃毒活性；另一方面制剂良好的渗透性可以使药剂在接触到目标害虫的身体时，能够迅速发挥其触杀活性。另外，施药方式应为叶面喷施，以保证药剂与植物大面积充分接触。

3种橐吾属植物提取物的毒力强弱表现为藏橐吾 ＞ 黄帚橐吾 ＞ 箭叶橐吾，其作用方式基本一致，说明3种植物之间可以进行资源互补。本研究室(甘肃省科学院生物研究所农业生物技术室)之前的研究对象集中在黄帚橐吾[1,9]，这主要是因为黄帚橐吾在甘南退化草地中的分布最为广泛、危害最为严重，因此将其作为资源植物开发的首选。Guo等[22]和四朗玉珍等[23]对藏橐吾提取物的抑菌活性进行了初步研究，均发现其具有较强的抑菌作用，但受试菌仅限于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。本研究结果表明藏橐吾提取物对于尖孢镰刀菌的菌丝生长有较强的抑制作用，同时具有3种橐吾属植物提取物中最强的杀虫活性，说明藏橐吾可以作为很好的候补资源或复配资源，具有极大的研究和开发潜力。

3种植物提取物作用于粘虫幼虫时，虫体大多在12 h内表现出不动、不食的麻痹状态，而后经过兴奋期，逐渐恢复，由此推测植物提取物可能首先作用于试虫的神经系统或消化系统发挥其活性。无论哪种供试植物提取物，试虫的较高死亡率均出现在用药后的48 h内，也观察到24 h内试虫死亡的现象，这可能与提取物中含有某些高效活性物质能够迅速发挥作用有关。高效活性物质的存在与否及其能够迅速发挥作用的机理都有待进一步的研究。更值得注意的是，3种植物皆为橐吾属，且作用方式类似，是否因为某种或某些橐吾属植物特有或共有的化学物质在发挥活性作用，这也有待于进一步深入研究。