响应面法优化超声乙醇提取南五味子藤茎中木脂素工艺

穆开朗，程昆木，王 锦，陈嘉悦

（安康学院，a.化学化工学院；b.秦巴中药资源研发中心，陕西 安康 725000）

木兰科植物五味子［Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.］属于敛肺涩肠类中药，因产地不同而分为南五味子和北五味子，具有收敛固滞、益气生津、补肾宁心等功效［1-4］。五味子因其临床治疗效果突出而广受市场欢迎。合格的五味子果实在其一个生长周期内需每年修剪3次藤茎，而这3次修剪后留下的藤茎常被当作废弃物丢弃，造成很大的浪费［5-8］。近年来，一些学者开始将关注点从五味子的果实转至五味子的藤茎上来。随着对五味子藤茎研究的深入，发现五味子的藤茎中也包含与其果实相同的主要药效成分——木脂素类成分［9，10］，在前期研究中发现五味子藤茎中也富含大量黄酮类、多糖类成分［11］。因此，五味子藤茎的开发利用具有广阔的前景。本研究以五味子藤茎中木脂素提取的最佳工艺作为切入点，在4个单因素试验的基础上，利用响应面Box-Behnken的试验设计方法，将超声功率、超声时间、超声温度、料液比作为试验考查因素，探究超声-乙醇提取五味子藤茎中木脂素的最佳提取工艺，为大量应用五味子藤茎及工业化高效提取藤茎中木脂素提供科学理论依据和工艺路线。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南五味子藤茎，陕西省安康市平利县。甲醇、无水乙醇（色谱纯），95%乙醇（分析纯），天津天力化学试剂有限公司；五味子乙素标准品，成都植标化纯生物技术有限公司；五味子酯甲标准品，江苏永健医药科技有限公司；三重蒸馏水，实验室自制。

1.2 仪器与设备

FW177型中草药粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；LC-10ATvp型高效液相色谱仪，日本岛津公司；YP5002型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；KQ2200E型超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；FA2014型精密分析天平，上海良平仪器仪表有限公司；Molbiochem 520型超纯制水机，重庆摩尔水处理设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的前处理将采集的五味子藤茎清洗干净，除去表面泥沙，晾干，在烘箱内60℃烘干，粉碎，过16目筛后存于干燥器中，备用。

1.3.2 单因素试验

1）超声功率对提取率的影响。精密称取样品粉末5份，每份3.000 0 g，在超声时间30 min，超声温度35℃，料液比1∶15（g/mL，下同）的条件下，超声功率分别设定为80、120、160、200、240 W提取木脂素并计算提取率。

2）超声时间对提取率的影响。精密称取样品粉末5份，每份3.000 0 g，在超声功率100 W，超声温度35℃，料液比1∶15的条件下，超声时间分别设定为30、40、50、60、70 min提取木脂素并计算提取率。

3）超声温度对提取率的影响。精密称取样品粉末5份，每份3.000 0 g，在超声功率100 W，超声时间30 min，料液比1∶15的条件下，超声温度分别设定为35、45、55、65、75℃提取木脂素并计算提取率。

4）料液比对提取率的影响。精密称取样品粉末5份，每份3.000 0 g，在超声功率100 W，超声时间30 min，超声温度35℃，料液比分别设定为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35提取木脂素并计算提取率。

1.3.3 响应面试验设计利用响应面Box-Behnken的试验设计方法，木脂素提取率作为响应值，将超声功率、超声时间、超声温度、料液比作为试验考查的影响因素，探究超声-乙醇提取南五味子藤茎中木脂素的最佳提取工艺，各影响因素与水平见表1。

表1 响应面设计因素与水平

1.3.4 数据处理采用Design-Expert 10软件对数据进行处理及分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声功率对五味子藤茎中木脂素提取率的影响由图1可知，当超声功率在80～200 W时，随着超声功率的增加，木脂素的提取率逐渐升高，到200 W时达到最大值，此时木脂素的提取率为0.275%。当超声功率大于200 W时，随着超声功率的增加，木脂素的提取率缓慢下降。可能是因为随着超声功率逐渐增大，机械剪切力也相应地不断增强，使得细胞破裂，木脂素类化合物从细胞内流出，但是当超声功率过大时，内部能量过大使得温度过高，木脂素类化合物的结构发生改变导致提取率下降，因此，选择超声功率200 W较合适。

图1 超声功率对木脂素提取率的影响

2.1.2 超声时间对五味子藤茎中木脂素提取率的影响由图2可知，当超声时间在30～60 min时，随着超声时间的增加，木脂素的提取率有明显的提高，当超声时间在60 min时，木脂素的提取率最大达0.265%。当超声时间大于60 min后，木脂素的提取率基本保持不变。这是由于随着超声时间的加长，木脂素类化合物逐渐从细胞内流出，溶于乙醇溶液中，直至达到最大值，因此，选择超声时间60 min较合适。

图2 超声时间对木脂素提取率的影响

2.1.3 超声温度对五味子藤茎中木脂素提取率的影响由图3可知，当超声温度在35～55℃时，随着超声温度的增加，木脂素的提取率不断升高，当超声温度在55℃时，木脂素的提取率达到最大值0.276%。当超声温度超过55℃后，木脂素的提取率逐渐下降。这是由于超声温度的逐渐上升，细胞内聚能升高使得细胞破裂，木脂素类化合物流出，溶于乙醇溶液中。但是当温度到达一定值后，木脂素类化合物发生氧化，使得提取率缓慢降低，因此，选择超声温度55℃较合适。

图3 超声温度对木脂素提取率的影响

2.1.4 料液比对五味子藤茎中木脂素提取率的影响由图4可知，当南五味子藤茎的料液比在1∶15至1∶30时，木脂素的提取率会因加入乙醇含量的增加而有所升高。在料液比1∶30时，木脂素类化合物的提取率达最高值0.269%，而且当南五味子藤茎料液比超过1∶30后，木脂素的提取率就会趋于稳定。这是由于细胞内流出的木脂素类化合物，在乙醇中的溶解度有一定的饱和度，随着乙醇含量的逐渐上升，木脂素类化合物在乙醇溶液中溶解的也越来越多，直到将木脂素类化合物全部溶解，因此，选择料液比1∶30较合适。

图4 料液比对木脂素提取率的影响

2.1.5 单因素试验结果的验证与分析由单因素试验得到超声乙醇法提取南五味子藤茎中木脂素的最优工艺，即超声功率200 W，超声时间60 min，超声温度55℃，料液比1∶30。根据以上单因素试验的结果，进行3次平行验证试验，得出南五味子藤茎木脂素提取率分别为0.259%、0.264%、0.252%，相对标准偏差RSD为3.62%，说明用此工艺条件对南五味子藤茎木脂素提取稳定可靠。

验证试验并未达到单因素试验中木脂素提取率的最大值，考虑可能是由于单因素试验未将因素之间的交互作用做分析，再加上单因素试验只能在各因素条件节点上取值，从而导致优化试验存在误差，试验结论可靠性不强。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面优化试验结果与方差分析以超声功率、超声时间、超声温度和料液比作为主要的影响因素，在这4个影响因素上分别选择3种水平，采用南五味子藤茎中木脂素的提取率作为响应值，超声-乙醇提取南五味子藤茎中木脂素的响应试验方案与结果见表2。

表2 响应面试验设计与结果

利用Design Expert 10软件对本次试验数据和影响因子进行二次回归模型的拟合，通过二次回归分析，回归方程如下：

对数据进行方差分析，由表3可知，二次多元回归模型P＜0.000 1，证明该回归模型是显著的；失拟项中F=0.49，P=0.837 8，失拟项不显著；二次多元模型相关系数R2=0.966 6，表明响应值变化有96.66%是和这4个因素有关。校正确定系数R2adj=0.982 7，表明试验模型的可靠性。D及交互项A D、C D、A2、B2、C2、D2的P均小于0.000 1，表明其对木脂素的综合提取率有显著影响。从A、B、C、D的F值顺序大小判断出各因素对木脂素提取率的影响大小顺序为D＞C＞A＞B。

表3 模型的方差分析

2.2.2 响应面交互作用响应面图形是反映响应值与各试验因素之间变化的三维图形，可从中分析出参数与最佳参数间的相互作用关系。当响应面为山谷型曲面时，有极小值存在；当响应面呈山丘状曲面时，说明模型存在极大值。测试因素间的交互作用关系由等高线的形状反映，若等高线曲线形状为椭圆形，则两因素的交互作用显著；若等高线曲线为圆形，则交互作用不显著，没有统计学意义。由图5可知，6组响应面均为山丘型，等高线形状均为椭圆形，说明各因素的相互作用均有最大值存在，且各因素交互作用显著。其中，图5b、c、e、f的响应面曲线走势较陡峭，等高线形状为椭圆形，说明这4组两两因素之间的交互作用对木脂素提取率影响显著。图5a和d的响应面曲线走势较为平缓，等高线形状较圆，说明这2组因素之间的交互作用对木脂素提取率影响较小。

图5 各因素交互作用对木脂素提取率的影响

2.2.3 优化与验证试验利用响应面分析得到理论最佳工艺，即超声功率160.19 W，超声时间50.18 min，超声温度54.77℃，料液比1∶27.07，该条件下木脂素的理论提取率为0.365%。为了保证响应面试验方案设计的可靠性，结合其实际运用条件，将最佳的条件修正为超声功率160 W，超声时间50 min，超声温度55℃，料液比1∶27。

选择修正后的提取条件，在此条件下重复试验3次，得到木脂素平均提取率为0.371%，与预测值相差1.64%，说明误差小，所建立的响应面优化模型真实可靠，证明本模型的预测精度良好，工艺重现性良好。

3 小结

从五味子中提取木脂素类化合物常用的方法包括有机溶剂回流提取法、连续回流提取法和超声辅助有机溶剂提取法［12，13］。超声波提取简单方便、绿色环保，而乙醇作为一种常用的有机溶剂，易获取且价格低廉，本试验借鉴从五味子中提取木脂素的方法，同时考虑到工业化从五味子藤茎中提取木脂素的可行性，因此，选择超声-乙醇法提取五味子藤茎中的木脂素［14-17］。

本试验采用超声辅助有机溶剂乙醇法，从南五味子藤茎中分别提取了五味子酯甲和五味子乙素，以五味子藤茎中含有的五味子酯甲和五味子乙素2种木脂素类化合物总量作为考察木脂素含量的主要指标，使用反相高效液相色谱法测定其含量，将超声功率、超声时间、超声温度和料液比作为影响因素，响应数值为木脂素的提取率。在单因素试验的基础上，采用响应面Box-Behnken设计优化试验，将分析得到的优化试验结果通过使用Design-Expert 10软件对其进行处理，得到本次优化试验的最佳工艺为超声功率160 W，超声时间50 min，超声温度55℃，料液比1∶27，预测提取率为0.365%，经过验证试验实际值0.371%，与预测值相差1.64%，说明该模型可以较好地优化超声-乙醇提取南五味子藤茎中木脂素的工艺条件。本研究对应用中药材五味子废弃部位及工业化开发利用五味子藤茎具有重要意义。