β-arrestin2通过调控自噬水平在结肠炎中的作用

郭佳翔 翟晓明 刘慧玲 徐敏仪 吴淑云 陶金

【摘要】 目的 研究β-抑制蛋白2 （β-arrestin2）是否通過调控自噬水平在结肠炎中发挥作用。方法β-arrestin2野生型（WT）小鼠和β-arrestin2基因敲除（KO）小鼠各20只，随机分为4组，每组各10只，分别为β-arrestin2 WT对照组和实验组，β-arrestin2 KO对照组和实验组。实验组小鼠自由饮用3%葡聚糖硫酸钠7 d诱导急性溃疡性结肠炎，对照组给予无菌ddH2O。观察并记录各组小鼠的疾病活动指数。收集小鼠结肠组织，免疫组织化学和蛋白免疫印迹法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3β（LC3B）、Beclin1的表达水平。在HCoEpiC细胞中，通过siRNA沉默β-arrestin2的表达，Earle’s平衡盐溶液（EBSS）处理细胞以诱导细胞自噬的发生，检测LC3B表达水平。结果 β-arrestin2 WT实验组小鼠的结肠黏膜自噬相关蛋白表达水平上调，而β-arrestin2 KO实验组小鼠的结肠炎症程度明显改善，自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达水平下降（P < 0.05），但Beclin1表达水平比较差异无统计学意义（P > 0.05）。在HCoEpiC细胞中沉默β-arrestin2的表达，EBSS处理后，LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达水平下调。结论 在结肠炎中，β-arrestin2调控自噬水平，当β-arrestin2缺失时，可以通过抑制自噬改善结肠炎。

【关键词】 溃疡性结肠炎;自噬;β-抑制蛋白2;小鼠;HCoEpiC细胞

【Abstract】 Objective To explore whether β-arrestin2 plays a role by regulating autophagy in colitis. Methods 20 β-arrestin2 wild-type （WT） and 20 β-arrestin2 knockout （KO） mice were randomly and evenly divided into four groups， including β-arrestin2 WT control group and experimental group， β-arrestin2 KO control group and experimental group. In the experimental groups， the mice were given free access to 3% dextran sulfate sodium （DSS） for 7 d to induce acute colitis. In the control groups， the mice were given sterile ddH2O. The disease activity index of mice was observed and recorded in each group. The colon tissues of mice were collected， and the expression levels of autophagy-related proteins including LC3B and Beclin1 were observed and detected by immunohistochemistry and western blot. The expression of β-arrestin2 was knockdown by siRNA in HCoEpiC cells， and then the cells were treated by Earle’s Balanced Salt Solution （EBSS） to induce autophagy. Then， the expression level of LC3B protein was detected. Results The expression of autophagy-related proteins was significantly up-regulated in the colon mucosal tissues of WT experimental mice. Compared with WT mice， the colonic inflammation was significantly ameliorated in β-arrestin2 KO mice after DSS treatment. And the expression levels of autophagy-related proteins LC3B-Ⅱ/Ⅰ were significantly down-regulated in β-arrestin2 KO mice in the experimental groups（P < 0.05）.There is no significant difference in the expression levels of Beclin1（P > 0.05）. After knocking down the expression of β-arrestin2 in HCoEpiC cells and EBSS treatment， the expression levels of LC3B-Ⅱ/Ⅰ were significantly down-regulated （P < 0.05）. Conclusion β-arrestin2 can regulate the autophagy in colitis， and the deficiency of β-arrestin2 can inhibit autophagy to ameliorate the colonic inflammation.

【Key words】 Ulcerative colitis; Autophagy; β-arrestin2; Mouse; HCoEpiC cell

溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性非特异性炎症性肠病（IBD），主要累及结直肠黏膜层及黏膜下层。血性腹泻、腹痛是UC最常见的临床症状。目前病因尚不明确，研究表明其与环境、遗传易感性、肠道菌群失调和免疫反应紊乱等因素相关[1]。自噬是真核细胞的一个基本生物过程，自噬通过对蛋白质和细胞器的分解代谢，在能量稳态中起重要作用，主要分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬等[2]。巨自噬是指内质网或高尔基体来源的隔膜在待降解物质周围形成自噬小体，运输至溶酶体内进行降解的过程。全基因组关联研究确定IBD的多个易感基因，大量的研究表明自噬在维持肠道内稳态中发挥着重要作用，可能与IBD的发病机制相关[3]。β-抑制蛋白2 （β-arrestin2）是Arrestins家族中的一员，是广泛存在于细胞膜和细胞质内的支架蛋白[4]。β-arrestin2不仅介导G蛋白偶联受体（GPCR）的脱敏、内化和信号转导;同时还通过参与胰岛素生长因子1（IGF-1）、核因子-κB （NF-κB）、p53、Wnt、PI3K/Akt等多条信号通路，进而调节细胞的趋化、凋亡、自噬等功能，在许多生理和病理过程中起着重要作用[5]。笔者团队既往的研究发现β-arrestin2可以促进葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎黏膜的细胞凋亡，然而在结肠炎中，β-arrestin2是否对自噬存在调控作用尚不清楚[6]。本研究通过建立β-arrestin2野生型（WT）和β-arrestin2基因敲除型（KO）小鼠急性UC模型以及干扰β-arrestin2在HCoEpiC细胞中的表达，探讨β-arrestin2在小鼠UC中对自噬水平的调控。

材料与方法

一、材 料

1.实验动物

SPF级别的C57BL/6J小鼠20只，雌雄各半，8周龄，体质量20～25 g，购自广东药康生物科技有限公司。β-arrestin2 KO小鼠于中山大学附属第三医院疫苗研究所动物中心进行繁育、饲养并用于实验。本动物实验伦理经中山大学实验动物管理与使用委员会审批通过（F2-09-0901）。

2.实验细胞系

人源的正常结肠上皮细胞系HCoEpiC细胞由中山大学附属第三医院消化内科实验室冻存保種。

3.主要试剂与抗体

DSS（MP Biomedicals，美国）、高糖DMEM培养基（Gibco，美国）、胎牛血清（Gibco，美国）、β-arrestin2 siRNA（吉玛基因，中国）、β-actin抗体（Santa Cruz，美国）、微管相关蛋白1轻链3β（LC3B）抗体（Abcam，美国）、 Beclin1抗体（CST，美国）、p-Akt（CST，美国）、β-arrestin2抗体（Proteintech，中国）、Earle’s平衡盐溶液（EBSS，Gibco，美国）。

4.主要仪器

二氧化碳培养箱（Thermo Scientific，美国）、SDS-PAGE电泳槽（BIO-RAD，美国）、半干转膜仪（BIO-RAD，美国）、PCR仪（BIO-RAD，美国）。

二、方 法

1.小鼠急性UC模型的建立

选取8周大的C57BL/6J小鼠，随机分为β-arrestin2 WT对照组、β-arrestin2 WT实验组、β-arrestin2 KO对照组和β-arrestin2 KO实验组，每组10只。WT对照组和KO对照组小鼠给予无菌的ddH2O自由饮用，WT实验组和KO实验组小鼠自由饮用含3%DSS的无菌ddH2O 7 d，诱导小鼠急性UC。

2.疾病活动指数评分

从造模的第1日起，每日观察小鼠的体质量、粪便性状和粪便隐血情况，计算小鼠疾病活动指数。具体评分标准如下：体质量正常为0分，体质量下降1%～5%为1分，下降5%～10%为2分，下降10%～20%为3分，下降大于20%为4分;大便成形为0分，呈糊状或半成形为1分，稀便为4分;粪便潜血阴性为0分，大便潜血阳性为2分，肉眼血便为4分。

3.小鼠结肠标本的收集

造模结束后，对小鼠进行腹腔注射10%水合氯醛，深度麻醉后行颈椎脱臼处死。剖开腹部暴露腹腔，取出全结肠，放置冰盒上。纵行剖开小鼠结肠，用预冷的生理盐水冲洗结肠内容物。部分结肠组织进行固定后续包埋，部分结肠组织刮取肠黏膜后置于-80℃冰箱中保存，后续提取蛋白质。

4. HE染色

将制备好的蜡块切片，进行脱蜡和梯度水化处理后，滴加苏木素染液30 s，流水冲洗后置于磷酸盐缓冲液（PBS）中反蓝。随后用伊红染液染色1 min，流水冲洗后显微镜下观察染色情况，封片，拍照。

5.免疫组织化学染色

将制备好的蜡块切片，进行脱蜡和梯度水化处理后，在3%双氧水中孵育10 min，然后进行抗原修复，用5%的牛血清白蛋白封闭30 min。一抗稀释液4℃孵育过夜，PBS清洗，对应的二抗稀释液37℃孵育2 h。PBS冲洗后DAB显色，蒸馏水终止反应。苏木素染液染色后，封片，拍照。

6.细胞培养

将HCoEpic细胞用完全培养基，置于5% CO2、37℃培养箱中进行培养，观察细胞的生长状况。待细胞处于对数增长期时，胰酶消化，用培养基重悬细胞，按1∶4的比例传代。

7. siRNA沉默β-arrestin2基因的表达

当细胞生长到50%的密度时，根据siRNA说明书进行瞬时转染，沉默β-arrestin2基因的表达。siRNA干扰效率通过实时荧光定量PCR（RT-PCR）和蛋白免疫印迹进行检测。将消化重悬的细胞铺于12孔板中，使24 h后达到50%，用siRNA沉默β-arrestin2的表达。EBSS处理细胞2 h。

8. 细胞RNA提取及RT-PCR检测mRNA表达

根据试剂盒说明书提取细胞中的总RNA，测定提取的RNA样品的纯度及浓度，逆转录后测定目的基因的mRNA表达水平。目的基因引物序列见表1。

9. 结肠黏膜和细胞总蛋白提取及蛋白免疫印迹

根据总蛋白提取裂解液说明书对结肠黏膜细胞总蛋白进行提取和定量。取蛋白样品进行电泳，转膜结束后，封闭2 h。用磷酸盐吐温缓冲液洗涤后，一抗4℃孵育过夜。磷酸盐吐温缓冲液洗涤后，对应的二抗室温孵育2 h，化学发光法显像，采用Image J图像分析软件进行灰度分析。

三、统计学处理

所得数据应用SPSS 21.0进行统计学分析。正态分布数据均以  表示，2组间比较采用两独立样本t检验。P < 0.05为差异具有统计学意义。采用GraphPad prism 8.0软件进行作图。

结 果

一、小鼠急性UC的结肠黏膜自噬水平上调

用DSS诱导β-arrestin2 WT小鼠进行急性UC造模后，与β-arrestin2 WT对照组相比，β-arrestin2 WT实验组小鼠结肠长度明显缩短，差异有统计学意义（t = 8.933，P < 0.001），见图1A和B。结肠切片HE染色结果显示，β-arrestin2 WT对照组结肠黏膜結构完整，腺体排列整齐，未见炎症细胞浸润，而β-arrestin2 WT实验组小鼠结肠黏膜结构被破坏，腺体结构紊乱，糜烂和溃疡形成，炎症细胞浸润，见图1C。以上结果说明小鼠急性UC造模成功。

根据免疫组织化学染色结果显示，与β-arrestin2 WT对照组小鼠相比，β-arrestin2 WT实验组小鼠结肠黏膜Beclin1表达水平明显增加，见图1D。蛋白免疫印迹分析结果显示，β-arrestin2 WT实验组小鼠结肠黏膜组织中自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ和Beclin1表达水平均高于β-arrestin2 WT对照组，2组蛋白相对表达量比较差异均有统计学意义（tBeclin1=2.907，tLC3B-Ⅱ/Ⅰ= 3.194，P均< 0.05），见图1E、F。

二、β-arrestin2的缺失减轻小鼠急性UC的炎症反应

小鼠自由饮用3%DSS 7 d后，收集小鼠部分结肠组织并制备成石蜡标本，HE染色结果显示，与β-arrestin2 WT实验组比较，β-arrestin2 KO实验组结肠炎症严重程度明显减轻，炎症细胞的浸润减少，见图2A。从第2日起至第7日，β-arrestin2 KO实验组的疾病活动指数均低于β-arrestin2 WT实验组，见图2B，且从第4日起，2组疾病活动指数比较差异均有统计学意义（P均< 0.01）。与β-arrestin2 KO实验组比较，β-arrestin2 WT实验组造模后结肠长度缩短更为明显，差异亦有统计学意义（t = 6.441，P < 0.001），见图2C、D。

三、β-arrestin2的缺失下调小鼠UC结肠黏膜和HCoEpiC细胞中的自噬水平

β-arrestin2 KO实验组Beclin1表达水平较β-arrestin2 WT实验组明显减少（图3A），蛋白免疫印迹分析结果显示，β-arrestin2 KO实验组和β-arrestin2 WT实验组的LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白相对表达量比较差异有统计学意义（t = 4.868，P < 0.01），但Beclin1表达水平比较差异无统计学意义（P > 0.05），见图3B、C。

在人源性结肠上皮细胞HCoEpiC细胞中，根据说明书使用siRNA进行瞬时转染，RT-PCR和蛋白免疫印迹结果表明，β-arrestin2 siRNA能有效地沉默β-arrestin2基因的表达，见图3D。在HCoEpiC细胞中沉默了β-arrestin2的表达后，采用EBSS处理细胞2 h，诱导细胞自噬的发生，免疫蛋白印迹结果显示，当沉默β-arrestin2的表达后，LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达水平降低，表明β-arrestin2的沉默可以下调自噬水平，见图3E。

讨 论

UC是一种累及结直肠的慢性非特异性炎症疾病，与多种致病因素相关，被认为与环境因素、遗传易感性、肠道微生物失调以及免疫功能紊乱有关[7-8]。β-arrestins几乎在所有组织细胞上表达，主要分为β-arrestin1和β-arrestin2，其中β-arrestin1存在于细胞质和细胞核中，而β-arrestin2仅存在于细胞质中[4]。作为衔接蛋白，β-arrestin2不仅介导GPCR的内吞和脱敏，是GPCR信号转导的负向调节因子;同时又参与多种信号通路的转导，调节细胞的增殖、凋亡、自噬、迁移、炎症等功能[5]。大量研究表明β-arrestin2可能通过多种途径调节炎症反应。β-arrestin2可以通过与IκBα结合从而阻止NF-κB降解，或与TRAF6结合从而阻止TRAF6寡聚化和自泛素化，从而抑制NF-κB的激活[9-10]。同时，β-arrestin2可以抑制自然杀伤细胞的毒性作用，参与调节T淋巴细胞的活化等[11-13]。β-arrestin2在肠道炎症中起保护作用还是损伤作用仍存在争议。已有研究表明，β-arrestin2可以通过调节Th1和Th17细胞的比例从而抑制肠道炎症的进展[13]。而β-arrestin2又介导肥大细胞对肠道通透性的调节，削弱结肠细胞间的紧密连接，增加细胞间的通透性[14]。本实验在β-arrestin2 WT小鼠和β-arrestin2 KO小鼠上建立了急性UC模型，通过HE染色、疾病活动指数、结肠长度对比等分析方法，再次验证了β-arrestin2的缺失可以减轻小鼠急性UC的炎症反应。

同时，既往研究报道，全基因组关联性研究证实了与IBD相关的多个基因位点的单核苷酸多态性如ATG16L、NOD2、LRRK2、IRGM等分别调控IBD中的自噬发生[3， 16]。研究表明，具有ATG16L1的单核苷酸多态性的人类细胞自噬受损，对病原体的清除能力减弱，潘氏细胞和杯状细胞功能紊乱[17]。目前已有大量的研究报道自噬在肠道固有免疫和适应性免疫中发挥着重要的作用。在固有免疫中，自噬与模式识别受体相互作用，如Toll样受体、Nod样受体等，识别并消除侵入细胞的病原体。同时在肠道中，内源性和外源性微生物可通过自噬进行抗原呈递，并对共生物抗原耐受性的产生具有重要作用[18]。许多自噬相关蛋白（如Beclin1、Atg3、Atg5和Atg7）对T淋巴细胞的生存、发育和成熟是必要的[19-20]。干扰自噬导致肠道内固有免疫和适应性免疫受损，自噬缺陷可影响细胞抗原肽的呈递、损害细胞内细菌清除能力等[16-18]。然而，自噬是把双刃剑，在炎症中具有双向调节作用，适当的自噬可以降解受损或衰老的细胞器以及错误折叠的蛋白质，而过度的自噬会引起细胞自噬性死亡。有研究报道，过度的自噬会损害上皮细胞的紧密连接，抑制过度的自噬，从而恢复ZO-1和E-cadherin的表达[21]。为此，我们在实验中先探究了小鼠急性UC模型中自噬水平的变化，通过蛋白免疫印迹、免疫组织化学等检测方法，发现诱导小鼠急性UC后，自噬相关蛋白的表达水平上调。而β-arrestin2的缺失可以改善小鼠結肠黏膜的炎症，于是我们进一步探究β-arrestin2是否可以通过调控自噬来调节肠道的炎症。因此我们分析了β-arrestin2 WT小鼠和β-arrestin2 KO小鼠在急性UC模型中自噬水平的变化，结果发现β-arrestin2的缺失可以抑制自噬的发生，进一步在人源性的结肠上皮细胞HCoEpic中进行验证。通过饥饿诱导细胞自噬的发生，发现沉默β-arrestin2表达的细胞中，自噬相关蛋白表达水平下降，自噬水平受到抑制。

综上所述，β-arrestin2的缺失抑制自噬的发生，缓解肠道的炎症反应，为UC的治疗提供新的理论依据。

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（收稿日期：2021-10-25）

（本文編辑：杨江瑜）