沙果多酚的提取及组成分析

廉晓芯， 朱若楠， 吴洪钦， 王 波， 王庆宇， 赵 强*

(1.北京林业大学 材料科学与技术学院，北京 100083； 2.科尔沁右翼前旗农业技术推广中心，内蒙古 乌兰浩特 137705)

花红(MalusasiaticaNakai)，又名沙果、文林朗果、林檎等，是一种果皮为红色，果肉为黄白色的蔷薇科苹果属植物，含有丰富的多酚、维生素、有机酸、膳食纤维等，具有除烦消食、明目泄火的作用[1]。沙果耐寒性强，主要分布于较为寒冷的内蒙古东北部地区，以内蒙古科尔沁右翼前旗为代表[2]。沙果中的多酚含量突出，具有很强的DPPH 自由基、羟基自由基及过氧化物清除能力，被称为“第七类营养素”[3]。沙果多酚的提取和应用是沙果增值的新途径，能有效促进其主产地科尔沁右翼前旗地区的农业经济发展。植物多酚常用的提取方法有无水乙醇浸提法、水浴振荡法、超声波提取法等[4-8]。传统的无水乙醇法提取率低、溶剂消耗量大；超声波提取法虽然耗时少、产量高，但能耗较高、对人体存在一定的伤害。采用水浴振荡辅助乙醇提取沙果多酚，可以弥补传统方法的不足之处。目前对于沙果青果和熟果中多酚含量及种类的报道较少，通过探究沙果多酚最优提取工艺，并进一步分析沙果果干中多酚种类，可以比较多酚种类对沙果青果和熟果营养价值的影响。利用水浴振荡辅助乙醇提取法提取沙果多酚，通过对沙果中多酚含量和种类进行检测，对比沙果青果、熟果多酚含量，考察多酚种类对沙果营养价值的影响，以期得出一种绿色环保、高效的沙果多酚提取方法，为沙果产业发展及其多酚类物质的开发利用提供理论基础。

1 实 验

1.1 原料、试剂与仪器

沙果，含水率9.4%，购自科尔沁右翼前旗恒佳果业公司，由该公司总经理李玉成鉴定为沙果(MalusasiaticaNakai)。沙果青果、熟果去核削片，保留熟果果核中果籽，一并置于55 ℃ 烘箱中烘干36 h，粉碎过25 mm筛后备用；没食子酸标准品、无水碳酸钠(AR≥99.5%)、福林酚染色剂、无水乙醇等均为分析纯；绿原酸、(+)- 儿茶素、原花青素B2、表儿茶素、阿魏酸、根皮苷、根皮素标准品等均为市售色谱级。

KQ5200B 超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；水浴恒温振荡器，金坛市荣华仪器制造有限公司；800Y 多功能粉碎机，永康市铂欧五金制品有限公司；UV-2600 型紫外可见光分光光度计，尤尼柯(上海)有限公司；Modulyod-230型真空冷冻干燥机，美国赛默飞世尔科技公司；Precision HLG3型真空旋蒸器，德国Heidolph公司；1260型液相色谱仪，日本安捷伦公司；Tensor27傅里叶变换红外光谱仪，德国Bruker 光谱仪器公司。

1.2 多酚含量标准曲线测定

多酚含量测定采用Folin-Ciocalteu法[9]，分别取20 g/L 没食子酸溶液0、 0.25、 0.50、 0.75、 1.00、 1.25和1.50 mL置于10 mL 容量瓶中，用体积分数60%乙醇溶液定容至10 mL，配制成质量浓度为0.0、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5和3.0 g/L的标准溶液。精确称取10 g 无水碳酸钠，用去离子水溶解定容至100 mL配制成10% Na2CO3溶液。摇匀并静置5 min。移取没食子酸标准溶液1.0 mL 于10 mL 比色管中，加入3.0 mL 福林酚试剂，再向比色管中加入1.0 mL 10% Na2CO3溶液，摇匀， 40 ℃水浴反应2 h后于765 nm处测定吸光度，绘制多酚标准曲线，得回归方程为Y=0.047 7X-0.008(R2=0.999 2)。

1.3 水浴振荡辅助乙醇提取沙果多酚的工艺优化

为进一步提高沙果多酚提取率，以多酚得率为考察指标，在前期研究的基础上，选择影响提取效果的4个提取条件(乙醇体积分数、振荡时间、料液比和振荡温度)为4个主要因素。每个因素选择3个水平进行L9(34)正交试验优化水浴振荡辅助乙醇提取沙果多酚(表1)。具体操作如下：

各取2 g沙果青果干粉末于100 mL 锥形瓶中，按一定料液比(1 ∶15～1 ∶25，g ∶mL)加入乙醇溶液(体积分数为50%～70%)，水浴(温度30～50 ℃)振荡处理(30～50 min)，真空抽滤后取滤液，用乙醇溶液定容至50 mL，摇匀。取1.0 mL上述溶液按照1.2节的方法测定吸光度，根据标准曲线计算待测液中多酚含量。用选择的较优提取沙果青果工艺对沙果熟果、果籽进行提取多酚，并按1.2节操作，计算多酚得率。

1.4 HPLC测定沙果多酚组成

参考文献[9-10]对多酚类化合物进行HPLC组分检测。色谱条件为：安捷伦1260液相系统，G4212B型DAD检测器，色谱柱为C18 PLUS柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。

HPLC 分析条件为[10]：A为0.1%甲酸，B为0.1%甲酸-乙腈(体积比50 ∶50)。流动相为A与B的混合液，且随时间变化，A与B的比例变化。梯度洗脱：0～45 min，77%～50% A，23%～50% B；45～65 min，50～20% A，50%～80% B；65～68 min，20%～0% A,80%～100% B；68～73 min，100% B；73～76 min，0%～77% A，100%～23% B；76～80 min，77% A23% B。检测波长为280 nm(原花青素)、 330 nm(酚酸),流速为1 mL/min，温度为室温(25 ℃)，进样量为20 μL 。

2 结果与分析

2.1 沙果多酚提取

2.1.1正交试验 选择乙醇体积分数(A)、振荡时间(B)、料液比(C)和振荡温度(D)4因素3水平进行沙果青果的L9(34) 正交试验，结果见表1。极差分析结果表明：影响沙果青果多酚得率的因素的主次关系是A>B>D>C，即乙醇体积分数影响最大，水浴振荡时间次之，水浴振荡温度第三，料液比最小，最佳工艺为A1B3C3D1，即乙醇体积分数50%，水浴振荡时间50 min,料液比1 ∶25，水浴振荡温度30 ℃。在该条件下进行3次验证试验，沙果青果平均多酚得率为(7.875±0.008) mg/g。

表1 沙果青果多酚提取正交试验结果

沙果熟果的L9(34)正交试验结果见表2。极差分析结果表明：影响沙果熟果多酚含量的因素的主次关系是D>C>A>B，即水浴振荡温度影响最大，料液比次之，乙醇浓度第三，水浴振荡时间最小，最佳工艺为A2B1C3D2，即乙醇体积分数60%，水浴振荡时间30 min,料液比1 ∶25，水浴振荡温度40 ℃。在该条件下进行3次验证试验，沙果熟果平均多酚得率为(10.259±0.020) mg/g。

2.1.2沙果青果、熟果多酚含量比较 在2.1.1节优选的提取沙果青果的工艺条件下，对沙果青果和熟果中多酚进行提取，多酚得率分别为(7.875±0.008)和(10.259±0.020) mg/g。由数据可知，两种不同样品提取条件中，熟果提取时用的乙醇体积分数(60%)虽略高于青果(50%)，但振荡时间(30 min)却低于青果(50 min)，在料液比相同和振荡温度相差不大的条件下，熟果多酚得率明显高于青果，较之提升了30.27%。由此可见，采用水浴振荡辅助乙醇提取沙果多酚时，熟果中多酚含量高于青果，而且提取熟果多酚明显缩短提取时间，降低能耗，提升效率，因此，熟果比青果更适宜作为沙果多酚提取的原料。

表2 沙果熟果多酚提取正交试验结果

2.2 沙果熟果果籽多酚粗提

由于实际生产中熟果果籽易于分离且其中多酚含量丰富，为实现沙果熟果全果的资源化利用，提取沙果熟果果籽中的多酚，测定其多酚得率以实现沙果熟果的多酚最大化提取。按沙果熟果多酚的最优提取方法进行，即乙醇体积分数60%，水浴振荡时间30 min,料液比1 ∶25，水浴振荡温度40 ℃。实验结果表明：沙果熟果果籽在此条件下进行多酚提取时多酚得率为7.416 mg/g，低于沙果中的多酚(10.259 mg/g)，但也具有非常可观的提取价值，在后续工业化提取多酚的过程中可省略除去果籽这一步骤，简化工艺的同时提高多酚得率。

2.3 沙果多酚粗提物的分析与表征

采用水浴振荡辅助乙醇提取法分别提取沙果青果多酚和熟果多酚，将绿原酸、(+)-儿茶素、原花青素B2、表儿茶素、阿魏酸、根皮苷和根皮素的混合多酚标准品溶液以及最佳工艺条件下提取得到的2种沙果多酚进行液相色谱分析[11-12]，通过液相色谱分析了2种方法提取的沙果多酚中酚组成，液相色谱图见图1(未去除溶剂峰和杂质)。

1.绿原酸chlorogenic acid; 2.(+)-儿茶素(+)-catechin; 3.原花青素B2 proanthocyanidin B2; 4.表儿茶素epicatechin;

从图可以看出，水浴振荡辅助乙醇提取法提取到的沙果青果多酚的组成与沙果熟果多酚组成基本相同，均主要含有4种多酚，分别是绿原酸、原花青素B2、表儿茶素和根皮苷，阿魏酸和根皮素未检出。而沙果熟果多酚中还检出含有(+)- 儿茶素。

为得到上述沙果多酚含量，将绿原酸、(+)- 儿茶素、原花青素B2、表儿茶素和根皮苷的6个标准溶液混合，以峰面积(y)对多酚质量浓度(x，g/L)求得线性方程和相关系数(R2)，结果见表3。由表可知，5种组分的线性方程的R2均大于0.999，表明线性关系良好。

表3 多酚的线性方程、R2和线性范围

由HPLC分析测试可知：沙果青果中绿原酸17.35 g/L(22.033 0%)，原花青素B26.989 g/L(8.875 00%)、表儿茶素4.686 g/L(5.950 0%)和根皮苷0.991 g/L(1.259 0%)。沙果熟果中绿原酸42.14 g/L(41.075 8%)，原花青素B25.787 g/L(5.641 3%)、表儿茶素8.541 g/L(8.325 2%)，根皮苷0.513 g/L(0.499 8%)和(+)- 儿茶素7.432 g/L(7.244 4%)。定量结果表明：无论是青果还是熟果，多酚占比最大的都是绿原酸，这可能是导致沙果独特的酸爽口味的主要原因。青果中多酚占比最少的是根皮苷，熟果占比最少为根皮苷。青果中检出的4种多酚占总多酚的38.117%，熟果中检出的5种多酚占总多酚的62.786 5%，沙果中仍有大部分未知多酚未检出。

液相色谱结果表明：利用水浴振荡辅助乙醇提取法提取沙果多酚，沙果熟果比沙果青果的多酚种类更丰富。绿原酸、(+)- 儿茶素、原花青素B2、表儿茶素和根皮苷作为植物多酚[13]，对人体具有优异的抗氧化[14]、抗衰老功效[15]，可有效预防由于氧化作用带来的人体心脑血管的肿瘤[16]、皮肤的衰老、肌肉骨骼的退化[17]和肠道菌群失调[18]。尤其是绿原酸及其衍生物具有比抗坏血酸、咖啡酸和生育酚更强的自由基清除效果，可有效清除DPPH 自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基，还可抑制低密度脂蛋白的氧化。绿原酸对有效地清除体内自由基、维持机体细胞正常的结构和功能、防止和延缓肿瘤突变和衰老等现象的发生具有重要作用[19]。食用沙果熟果不仅风味更佳，营养价值也高于青果。目前对于沙果中多酚成分的研究较为少见，采用环保安全且高效的水浴振荡辅助乙醇提取沙果多酚是一种理想的实验方法。

3 结 论

3.1采用水浴振荡辅助乙醇提取沙果青果和熟果多酚，通过正交试验对提取工艺条件进行优化,得到水浴振荡辅助乙醇提取沙果青果多酚最佳提取工艺条件为乙醇体积分数50%，料液比1 ∶25(g ∶mL)，水浴振荡时间50 min，水浴振荡温度30 ℃；提取沙果熟果多酚最佳提取工艺条件为料液比1 ∶25(g ∶mL)，乙醇体积分数60%，水浴振荡时间30 min，水浴振荡温度40 ℃。最佳提取工艺条件下熟果青果多酚含量为(7.875±0.008) mg/g，熟果多酚含量达到(10.259±0.020) mg/g。水浴振荡辅助乙醇提取沙果多酚时，沙果熟果多酚含量明显高于沙果青果多酚含量。

3.2液相色谱分析表明：水浴振荡辅助乙醇提取法所得沙果熟果和青果多酚的组成均主要含有4种多酚，且沙果熟果中还含有(+)-儿茶素。沙果青果中绿原酸17.35 g/L(22.033 0%)，原花青素B26.989 g/L(8.875 00%)、表儿茶素4.686 g/L(5.950 0%)和根皮苷0.991 g/L(1.259 0%)。沙果熟果中绿原酸42.14 g/L(41.075 8%)，原花青素B25.787 g/L(5.641 3%)、表儿茶素8.541 g/L(8.325 2%)，根皮苷0.513 g/L(0.499 8%)和(+)-儿茶素7.432 g/L(7.244 4%)。沙果熟果比沙果青果的多酚种类更丰富，含量更高。目前对于沙果中多酚成分的研究较为少见，采用环保安全且高效的水浴振荡辅助乙醇提取沙果多酚是一种理想的实验方法。