骨骼干细胞的研究进展

林茜茜，张 龙，袁桂鑫，吴佐星，冯昊天，李 娜，许 韧*

(1.厦门大学医学院，细胞应激生物学国家重点实验室，福建 厦门 361102；2.汕头大学医学院第二附属医院，广东 汕头 515041；3.内蒙古乳业技术研究院有限责任公司,内蒙古 呼和浩特 010110；4.内蒙古伊利实业集团股份有限公司,内蒙古 呼和浩特 010110)

骨骼干细胞(SSCs)的定义基于特异性的细胞表面免疫标志物，是一个相对较新的概念.近期，Chan等[1-2]利用单细胞测序、流式细胞分选和谱系示踪技术相继鉴定出小鼠和人类的SSCs及其分化等级.SSCs的概念区别于间充质干细胞(MSCs).MSCs主要存在于骨髓腔内，具有分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的多向分化潜能；而SSCs主要位于生长板和骨外膜，能够分化为成骨细胞、软骨细胞和基质细胞，但不具备分化成脂肪细胞的能力[3-4].本文分别从基本定义和分化等级、骨内的组织分布情况、骨骼损伤修复中的作用及临床骨骼疾病中的应用4个方面详细阐述SSCs目前的研究进展.

1 SSCs的定义及分化等级

小鼠的SSCs是从新生小鼠的长骨中分离得到的，通过CD45-TER119-TIE2-ITGAV+CD200+(CD45为白细胞共同抗原，TER119为红细胞表面抗原，TIE2为内皮细胞Tek酪氨酸激酶，ITGAV为整合素αV，CD200为Ox-2膜糖蛋白)分选并定义小鼠的SSCs[1].通过流式分析、单细胞测序和免疫荧光染色的方法，人类的SSCs最初在17周胎儿长骨生长板中被鉴定，并定义为CD146-PDPN+CD73+CD164+(PDPN为平足蛋白)的一群细胞.这群细胞具有自我更新的能力，能够连续产生细胞群落形成单位，在小鼠肾下移植，能够分化出含有骨、软骨和基质的多向性小骨[2]：首先分化出早期骨、软骨和基质的祖细胞，接着是骨祖细胞和软骨祖细胞，最后才分化出骨骼细胞、软骨细胞和基质细胞.然而，人类SSCs不会分化为脂肪细胞.在急性骨骼损伤后，人类SSCs会在损伤部位发生显著的局部扩张，表明人类SSCs作为干细胞对骨骼损伤具有再生反应.此外，分化出的基质可以在无血清培养条件下维持人造血干细胞的生长，还能够表达多种潜在的造血支持细胞因子，包括人血管生成素1(ANGPT1)、集落刺激因子1(CSF1)、C-X-C基序趋化因子配体12(CXCL12)、白细胞介素-27(IL-27)、IL-7和干细胞因子(SCF)等.研究人员进一步探索人类SSCs的起源，通过单细胞转录组测序，分析孕5周和8周的人类胚胎的肢芽和长骨样本，发现一群具有分化为成骨前体细胞和软骨细胞潜能的胚胎骨骼干祖细胞(eSSPC)；这群细胞定位于软骨外膜，具有自我更新的能力和分化潜能；转录调控网络分析发现eSSPC中富集转录因子FOXP1/2[5].免疫荧光染色显示FOXP1/2+细胞主要定位于软骨外膜和新生的初级骨化中心内部，类似于小鼠体内发现的位于软骨外膜的Foxp1/2/4调控的前体细胞[5-6].

小鼠和人类的SSCs(及其相应的祖细胞)的分化等级可以根据其细胞表面的免疫标记变化定义.小鼠SSCs(ITGAV+CD200+)处于分化的最顶端，进一步分化为骨、软骨和基质祖细胞(BCSP,ITGAV+CD105+).BCSP仍具有多向分化的能力，可以分化为骨祖细胞(ITGAV+CD105+Thy+,其中Thy为胸苷酸合成酶)、软骨祖细胞(ITGAV+CD200+CD105+Thy+)、基质细胞(6C3+)和B淋巴细胞(ITGAV+Thy+).人类的SSCs(CD164+PDPN+CD73+)具有最强的自我更新和分化能力，类似于小鼠的分化等级，人类SSCs分化成具有多向分化能力的BCSP(CD146+PDPN+).人类的BCSP可以分化成软骨祖细胞(CD146-PDPN+)、骨祖细胞(CD146+ThyhighPDPN-)和基质细胞(CD146+ThylowPDPN-)[1-2].目前，SSCs的研究仍存在一定的局限，分化等级还需要进一步细化，主要是各分化阶段SSCs所处的空间及微环境仍有待进一步阐明.

衰老的SSCs会产生一种炎症退化微环境，不仅会导致骨折愈合不良、骨质疏松症、各种血液疾病，还会促进全身细胞和系统的普遍炎症，加速全身衰老.Ambrosi等[7]研究发现：在骨折愈合的过程中，骨折处形成骨痂，骨痂内充满SSCs；而在年老小鼠中，愈合部位的SSCs明显减少.此外，与年轻的SSCs相比，体外衰老的SSCs形成集落或成骨的能力也较差.正常情况下，骨组织在旧骨吸收、新骨形成的动态平衡中不断地更新、修复，但在年老的骨骼中，衰老的SSCs所表达的基因与骨形成减少和骨吸收增加有关，这种不平衡最终导致骨质疏松症以及骨折愈合延迟.适量的CSF1是骨骼愈合所必需的，与年龄有关的CSF1数量的增加会刺激破骨细胞的增多，因此衰老的SSCs分泌的CSF1增加导致骨吸收增加.通过抑制这一基因的表达，可以促进老年小鼠骨折部位的愈合.此外，他们还发现一种叫做骨形态发生蛋白2的SSCs刺激信号分子的产生减少，也是老年小鼠出现骨质疏松症和骨折愈合延迟的原因之一.本文后续讨论的SSCs均为小鼠的SSCs.

2 SSCs在骨骼中的分布

2.1 生长板上的SSCs

长骨的纵向生长是由生长板完成的，其中缓慢循环的细胞(静息区)产生增殖的成软骨细胞柱(增殖区)，然后成熟为肥大的软骨细胞(肥大区).在肥大区的末端，生长板软骨通过骨化过程被侵蚀并被骨和骨髓组织取代.生长发育时期骨的纵向延伸一直被认为由静息区的软骨祖细胞维持，但并没有被证明.Newton等[8]通过多色报告谱系示踪小鼠发现，在胎鼠和新生鼠中Ⅱ型胶原α1链阳性(Col2a1+)的软骨祖细胞具有自我更新的能力，在次级骨化中心形成后，转变成稳定的单向分化的增殖区软骨细胞.此外，Mizuhashi等[9]发现一群表达甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)的细胞：在小鼠胚胎期至小鼠出生(P0)期间主要分布于生长板边界.出生后P6至P14期间，PTHrP+细胞数量逐渐增多，并分布于小鼠长骨整个生长板的静息区内.PTHrP+细胞不表达Col1a1但表达Sox9，是生长板静息区内的软骨细胞，能进一步分化成肥大软骨细胞，并转变成间充质前体细胞，进而分化为成骨细胞和骨髓基质细胞.虽然PTHrP细胞对成体骨的贡献较小，但是PTHrP来源的基质细胞并不会在成年后消失，在3个月、半年、一年的生长板区域仍能追踪观察到PTHrP+细胞及其子代细胞.PTHrP与肥大区释放的印度刺猬蛋白(Ihh)的相互作用，因此Hedgehog通路相关蛋白的正常表达是维持PTHrP+细胞分化命运的必要条件[10].

Gulati等[11]通过细胞表面标记定义小鼠(CD45-TER119-TIE2-ITGAV+CD200+)及人类(CD45-CD235a-TIE2-CD31-PDPN+CD73+CD164+)长骨生长板中的SSCs,虽然在分选小鼠SSCs的方法中并未特别分离生长板位置的SSCs，而是将整块骨头进行消化与流式分选，但是小鼠长骨分区域流式分析结果表明ITGAV特异表达于生长板，因此认为ITGAV+CD200+细胞主要位于生长板.由于这群干细胞在生长板中的具体空间位置还不清楚，所以CD200+的SSCs与Col2a1+的软骨祖细胞是否存在关联还有待阐明[1].此外，2021年Matthews等[12]研究报道，利用Gulati等[11]的表面标志物所鉴定出的SSCs(CD45-CD51+CD90-Ly51-CD105-CD200+，Ly51为谷氨酰氨基肽酶，自然杀伤细胞表面标志物)和BCSP(CD45-CD51+CD90-Ly51-CD105+)，在骨外膜上约10%、在骨内膜上20%～40%的细胞表达成熟成骨细胞表面标志物Col1a1(2.3 kb).由此可见CD200+细胞具有异质性，进一步细化SSCs的特异性表面标记非常必要.

出生后小鼠长骨中的SSCs可以分为两类：早期的骨软骨干细胞(ocSSC)和血管周骨骼干细胞(pvSSC)，两种干细胞均具有自我更新的能力.ocSSC主要参与长骨的生长和缺损修复，在体内能分化为骨细胞、软骨细胞和基质细胞，可以用CD45-TER119-TIE2-Thy1-Ly51-CD105-CD51+标记；pvSSC可以通过CD45-CD31-Pdgfrα+Sca1+CD24+(Pdgfrα为血小板生长因子受体α，Sca1为干细胞抗原1)区分，主要分布在骨髓中，参与造血干细胞微环境的塑造和再生，并且是骨髓内脂肪组织的来源[13].CD51是成骨细胞的特异性标志物，在长骨生长板中高表达；CD200+CD51+的干细胞能分化成BCSP，由表面标记CD51+CD105+区分；BCSP移植到肾囊腔后能够形成没有髓腔的骨小体，说明其多向分化的能力比ocSSC的低[14].

2.2 骨髓腔内的SSCs

骨髓腔是MSCs或骨髓基质细胞(BMSCs)主要集中的部位.MSCs属于具有干细胞特性的一群高度异质性细胞.目前骨髓腔内多种标志物，包括Grem1(Gremlin1)、家族锌指蛋白1(Gli1)、瘦素受体(LepR)、神经上皮干细胞蛋白(Nestin)、EBF转录因子3(Ebf3)、Cxcl12等已被证明可以标记MSCs.Nestin能标记成骨前体细胞，Mx1+细胞能分化为骨细胞，但是不能分化为软骨细胞和脂肪细胞[15-16].小鼠出生后早期阶段，表达Bmp拮抗剂Grem1+的细胞主要位于生长板下方的干骺端处，能够分化为骨细胞、软骨细胞和基质细胞，但是不能分化为脂肪细胞，在骨发育、骨重建和骨折修复中发挥作用.Grem1+细胞不表达Nestin和Cxcl12，不同于血窦血管周围的SSCs[17].BMSCs可以被区分为干骺端间充质干细胞(mpMSCs)和髓内间充质干细胞(dpMSCs)，mpMSCs分化为成骨细胞的能力更强，并且是dpMSCs的重要来源.dpMSCs主要包括LepR+骨髓间充质细胞及其他骨髓腔内基质细胞.由Pdgfrβ+标记成年小鼠的mpMSCs具有多向分化潜能，在损伤后能分化为脂肪细胞[18].

LepR是一个能够高度富集骨髓MSCs的标记物.Zhou等[19]研究发现：不同于Grem1+细胞，LepR+细胞出现在出生后较晚的时间点(出生后3个月达到高峰)，而且LepR+细胞一般分布在血管周围，能分化成脂肪细胞.约0.3%的骨髓细胞是LepR+细胞，而LepR+细胞中10%具有多向分化潜能，并且占骨髓腔具有多向分化潜能细胞的94%.LepR+细胞在体外培养和体内移植实验中能分化形成骨、软骨和脂肪组织.LepR+细胞在出生后才逐渐增加，是成年小鼠骨髓腔大多数骨细胞和脂肪细胞的来源.生理条件下，LepR+细胞是静息的，但在受伤后它们进入增殖状态，包括辐照后的骨再生和骨折愈合.瘦素水平的升高具有提高骨髓MSCs成脂、降低其成骨的功能，瘦素-LepR信号通路在调节成脂和成骨中具有关键作用[20].Shu等[21]发现，青春期前后的骨形成分别由软骨蛋白聚糖Acan+的生长板软骨细胞和LepR+骨髓MSCs主导，它们分别调节骨的增长和增厚，两种不同来源的干细胞在骨骼生长发育中具有不同分工.这种转变从干细胞的角度解释了哺乳动物的肢体骨骼如何在青春期后从快速的纵向生长过渡到缓慢的同位重塑.

骨髓是成年小鼠的造血器官，骨髓腔内的SSCs除分化为骨和软骨外，还为造血细胞提供了微环境.骨内膜成骨细胞、血管周基质细胞(包括血管内皮细胞)、Cxcl12高表达的网状细胞、LepR+的基质细胞和Nestin+的MSCs都参与造血干细胞的维持.Cxcl12在造血干细胞的维持中发挥着重要作用，Ebf3标记一部分LepR+的MSCs，这群细胞同时表达Cxcl12，参与维持造血干细胞的功能.在MSCs(Prx1+)中敲除Cxcl12会导致造血干细胞和B淋巴祖细胞的减少[22].

2.3 骨膜上的SSCs

骨膜是一种复杂的组织，排列在骨骼的外表面，由成纤维细胞、血管、神经以及内层的骨祖细胞组成.生长板在纵向骨骼延伸中起主要作用，而骨膜中的细胞在骨的发育和骨量平衡过程中有助于骨骼增厚和骨皮质的维持[23].近期，骨膜中的SSCs被相继鉴定，更明确了SSCs在骨发育和骨修复中的作用[24].

Hedgehog通路是骨与软骨发育中的重要通路，Gli1是Hedgehog通路的下游转录靶点.Gli1来源的细胞能标记生长板软骨外膜，并分化为骨皮质和骨小梁处的成骨细胞、骨髓腔内的BMSCs和脂肪细胞.追踪E13.5的Gli1+细胞生长至两个月，其中约75%的Gli1+细胞同时表达LepR，提示胚胎起源的Gli1+细胞是小鼠成年后骨髓腔内LepR+细胞的部分来源；但是因为在生长板中也有Gli1的表达，所以不能确定这部分Gli1细胞是否完全来源于骨膜[25].Gli1+细胞与Grem1+细胞类似，提供了年轻小鼠骨生长所需的干细胞，但其并不是长期维持骨平衡的干细胞类型.Axin2是Wnt的下游蛋白，与Gli1类似，也能标记早期骨膜上的SSCs[26].配对相关同源基因1(Prx1)能标记四肢骨的MSCs，从骨膜分离出的Prx1+细胞表达多个BMSCs的标志物，如Pdgfrα、Grem1、Cxcl12和Nestin.将骨膜中的Prx1+细胞移植到骨折损伤处，Prx1+细胞能够分化成祖细胞，具有自我更新的能力[27].Y染色体性别决定区(SRY)转录因子Sox9是成年小鼠骨膜中干细胞的标志物，在骨折损伤时，Sox9+细胞被诱导分化成软骨，参与骨损伤的修复.

在骨膜上，还存在一群由α-肌动蛋白(α-SMA，别名Acta2)标记的长期的成骨成软骨祖细胞.α-SMA+细胞在骨折愈合过程中发挥重要作用，其被激活并分化为软骨细胞和成骨细胞.在骨髓腔和骨内膜也存α-SMA标记的成骨成软骨祖细胞，但是大部分α-SMA+细胞还是集中在骨外膜上[28-29].α-SMA+细胞是具有异质性的一群细胞，其中大部分为表达CD51和CD90的SSCs[12].另一个骨膜SSCs的重要标志物是组织蛋白酶K(Ctsk).传统认为Ctsk是骨髓腔内破骨细胞的标志物，近期发现Ctsk还能标记骨膜来源的中胚层间质前体细胞，主要参与长骨的膜内成骨，在骨皮质的增厚中发挥重要作用.Ctsk+细胞不仅标记长骨的骨膜，还标记颅骨的骨膜.颅骨的形成主要依赖膜内成骨，这也验证了Ctsk+细胞是参与膜内成骨的一群成骨前体细胞.骨膜中分离的Ctsk+细胞具有自我更新的能力，并且能在体外培养中分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞.Ctsk+细胞能分化为骨皮质中的成骨细胞，但是不分化为骨髓中的成骨细胞[30].然而，在骨折损伤的修复中，Ctsk+细胞会发生转变，通过软骨内成骨的方式参与骨折的修复[30].

2.4 SSCs的时空特异性

SSCs在不同部位的骨骼上表达不一样的标志物，特定标记的SSCs在骨骼发育的不同阶段会出现表达峰值的交替变化，可见SSCs在时间和空间上均有其自身的规律.成骨相关转录因子Osx+(Osterix阳性)干细胞或前体细胞则随着骨骼发育不同阶段出现这类表达峰值交替变化的现象，在胚胎期，Osx+细胞是骨髓腔内新形成骨的来源，在小鼠成年后被替代；在新生小鼠阶段，Osx+细胞标记骨髓腔中的成骨细胞和长期存在的基质细胞；成年小鼠体内的Osx+细胞在骨组织损伤时参与组织的修复[31].Hox11只特异性标记了Zeugopod(尺骨和桡骨、胫骨和腓骨)骨髓腔内的MSCs和骨外膜上的成体SSCs，而在股骨、肱骨等其他部位，骨髓腔内的MSCs则表达其他的Hox家族基因[32].

综上所述，目前研究发现的SSCs主要分布于长骨内的生长板、骨髓腔和骨膜上，分别由不同的标志物标记(图1).

图1 SSCs在长骨中的分布

3 SSCs在骨修复中的应用

目前，人类骨骼系统疾病的治疗策略主要是以结构重建为基础，通过手术治疗恢复躯体正常的运动结构或解剖结构，以达到良好的运动功能为最终目的.干细胞具有自我更新能力和多向分化潜能，已有多种干细胞用于临床研究，如BMSCs、脂肪干细胞、脐带间充质干细胞等.对于SSCs的分类和功能，其基本定义、分化等级及骨内的组织分布情况已逐步被探明，然而SSCs的功能亟待阐明.诸多基础研究已表明SSCs在骨骼发育及骨修复中扮演着重要的角色.研究表明SSCs与年龄相关性软骨再生能力关系密切.通过成年小鼠关节软骨的微骨折模型实验，证实了微骨折能够激活SSCs参与软骨修复过程，并且小鼠和人类SSCs活性随着年龄增加，进行性丧失与软骨生成减少呈正相关[33].在急性骨损伤中，小鼠BCSP表达CD49f并被激活以促进骨修复.相比之下，这些骨折诱导产生的小鼠BCSP在未受伤的骨骼中并不存在[34].在人骨异种移植模型(在免疫缺陷小鼠上移植了胎儿带完整骨膜的指骨移植物)上评估SSCs的能力，研究发现人类SSCs在急性骨损伤的损伤部位明显增加，证实了人类SSCs对骨骼损伤的再生能力[2].在糖尿病患者膝关节的标本中，观察到Ihh基因的表达下降，在小鼠中通过Ihh的外源性递送来挽救后诱导SSCs生成可促进骨愈合[35].而在小鼠下颌牵引成骨过程中，黏着斑激酶(FAK)通过驱动SSCs再生促进骨修复；随着FAK的抑制，SSCs驱动的骨再生能力严重受损，导致纤维瘢痕组织代替骨的生成[36].这些研究强调了SSCs在骨修复中的重要性.

4 总结与展望

SSCs具备自我更新能力，只发育为骨和软骨，而非脂肪、肌肉或其他组织，在临床骨科疾病的治疗中具有很大的潜力.骨不连和骨缺损是骨科治疗中常见的棘手问题，目前的方案包括常规稳定手术治疗和非手术治疗，但传统游离植骨术需要经过漫长的爬行替代过程，而器械导致的骨面加压或扩髓则可能会进一步增加感染风险.近年随着组织工程和分子生物学临床应用的飞速发展，采用分子生物学方法治疗骨不连和骨缺损的研究备受学者关注[37].与传统的高分子材料或金属材料相比，BMSCs联合复合支架载体具有较高的天然骨仿生性、力学性能和低免疫排斥反应，成为骨再造组织或器官的临床研究重点[37].研究显示，BMSCs联合壳聚糖-P24/羟基磷灰石复合材料支架可提高材料与骨质的整合修复效率[38].三维打印仿生羟基磷灰石支架的纳米结构和孔结构可增强BMSCs向成骨细胞分化的诱导能力，进而获得优异的骨传导性能和骨再生能力[39].作为骨组织的干祖细胞，SSCs联合低免疫排斥的生物支架将可能是修复骨不连和骨缺损的最理想方式之一.

近年组织工程和干细胞分子生物技术的兴起，为关节软骨的修复再生开辟了新途径.目前软骨组织工程多依靠BMSCs联合使用细胞外基质结构，如BMSCs联合聚乙烯醇/聚己酸内酯用于修复鼠全层软骨缺损，BMSCs薄板与聚乳酸乙醇酸/MSCs联合应用可增强软骨再生能力，提升再生软骨与周围软骨的整合效率[40-41].SSCs的自我更新能力和成软骨潜能使SSCs在联合低免疫排斥生物支架材料修复软骨缺损疾病中扮演重要角色，将给关节镜和再生医学领域带来改变.椎间盘退行性疾病源于遗传学、机械力学和椎间盘微环境的改变，是脊柱外科常见的高发病率疾病，也是下腰痛的主要原因.目前椎间盘退变的治疗方案有非手术治疗和手术治疗，但均未能改变椎间盘退变的病理状态.干细胞组织工程为椎间盘退变治疗提供了新方案：BMSCs复合葡萄聚糖-明胶水凝胶装载转化生长因子β3(TGF-β3)的生物支架可诱导BMSCs向髓核样细胞分化，并检测到细胞外基质基因的表达[42].另外，京尼平交联复合生物支架负载脂肪干细胞同样可诱导干细胞髓核样分化，加强了椎间盘的再生能力[43].在临床治疗上，采用BMSCs髓核内植入技术治疗10例下腰痛患者，获得较好的临床预后，也证实了干细胞干预椎间盘疾病的可行性和可靠性[44].与BMSCs相比，SSCs是一类异质性较低、表面生物标志物可靠且生物学特性稳定的干细胞群落，可以联合使用促分化因子或生物组织工程，以达到对椎间盘退行性疾病损伤修复的高效治疗.

总之，目前的研究结果已经初步按空间分布将SSCs划分成生长板上、骨髓腔内和骨膜上3类，并进一步确认了SSCs及成骨祖细胞的分化阶段细胞表面标记物的变化.然而，不同的SSCs在骨骼内的生物学作用还有待进一步阐明.另外，进一步完善SSCs的鉴定和功能，并阐明SSCs在细胞分子和组织结构层面的调控作用机制，有望将其与传统疗法相结合，为干细胞治疗提供新策略，为人类的健康和生活带来新希望.