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安罗替尼通过上调miR-33b抑制PI3K/AKT信号通路来抑制HeLa增殖、迁移侵袭的作用机制

2022-05-19陈彦民邹明雷王珍珍吕晶晶

实用癌症杂志 2022年5期
关键词:安罗小室抑制率

陈彦民 邹明雷 李 丽 王珍珍 吕晶晶

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。据估计,全世界约有140万妇女患有宫颈癌(仅次于乳腺癌)。早期发现可在降低相关发病率方面发挥关键作用,但是临床上多数患者确诊时已至晚期[1,2]。因此,寻找高效的治疗药物在临床上具有重要意义。安罗替尼(anlotinib)是一种口服多受体酪氨酸激酶小分子抑制剂,对肿瘤血管的生成和生长有广泛的抑制作用。安罗替尼在中国被批准用于治疗局部晚期或转移性非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)患者,目前其处于Ⅱ期和/或Ⅲ期临床试验阶段[3-5]。但是,安罗替尼对宫颈癌是否有疗效尚未清楚。本研究旨在探究安罗替尼对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

宫颈癌细胞HeLa由上海中国科学研究院细胞库馈赠;改良杜氏细胞培养基(dulbecco's modified eagle medium,DMEM)购自美国 Gibco公司;小牛血清购自杭州四季青公司;细胞计数试剂盒(cell count kit,CCK-8)购自上海碧云天公司;迁移实验(Transwell)小室购自美国Corning公司。所有引物、质粒的序列均由上海吉玛公司设计合成。兔单克隆抗体CyclinD1、MMP2、MMP9、p-PI3K、p-AKT均购自上海艾博抗公司;辣根过氧化物酶标记的二抗购自北京凯瑞基生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养 宫颈癌细胞HeLa的培养:DMEM+10%胎牛血清+1%青链霉素混合液培养,在37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养、传代。

1.2.2 细胞分组 将正常培养的HeLa细胞标记为NC组。安罗替尼(4、8、16、32 μmol/L)处理HeLa细胞48 h,分别标记为4 μmol/L安罗替尼组、8 μmol/L安罗替尼组、16 μmol/L安罗替尼组、32 μmol/L安罗替尼组,选取16 μmol/L安罗替尼组细胞标记为安罗替尼组。使用3~5倍质粒或DNA量的脂质体将miR-NC(miR-NC组)、miR-33b(miR-33b mimics组)、anti-miR-NC(anti-miR-NC组)、anti-miR-33b(anti-miR-33b组)、16 μmol/L安罗替尼+anti-miR-NC(anti-miR-NC+安罗替尼处理组)、16 μmol/L安罗替尼+anti-miR-33b(转染anti-miR-33b+安罗替尼组),转染至HeLa细胞,转染8 h后,补充新培养基继续培养48 h,然后用于qRT-PCR实验检测转染的效率。确认转染成功后方可用于后续实验。miR-NC、miR-33b mimics和anti-miR-NC、anti-miR-33b均由上海吉玛公司完成。

1.2.3 CCK-8实验 收集对数增殖期需要检测的细胞,将其按照CCK-8试剂盒说明书要求对细胞进行处理,添加CCK-8反应液,孵育4 h后,将其置于酶标仪中,在490 nm波长下检测细胞的吸光值(A)。增殖抑制率为(1-A样本/A对照)×100%。

1.2.4 Western blot实验 将需要检测的细胞裂解后提取总蛋白。取定量后的蛋白50 μg进行蛋白电泳上样,然后将蛋白用转膜仪转移至PVDF膜上。再用2.5%的脱脂奶粉将膜在室温下封闭处理2 h。结束后,进行一抗(CyclinD1,1∶1000;MMP2,1∶1500;MMP9,1∶1000;p-PI3K,1∶2000;p-AKT,1∶1000)4℃孵育过夜,二抗(辣根过氧化物酶标记的二抗,1∶2000)37℃孵育2 h。最后将膜用电化学发光试剂盒进行显影曝光。用Quantity One软件将目的条带的灰度值与内参的灰度值之比表示目的蛋白的表达。

1.2.5 Transwell小室实验 选用含有基质胶的小室检测细胞的侵袭能力,不含基质胶的小室检测细胞的迁移能力。具体操作步骤为:先将需要检测的细胞用不含血清的DMEM培养基培养12 h,进行饥饿处理。取约104个细胞均匀浸润小室的上层膜,再将下室中加入600 ml的含血清的培养基,在恒温培养箱中培养过夜(约 12 h)。取出小室,擦去残余细胞,将穿过膜的细胞进行固定、染色。最后在显微镜下对细胞进行计数,取平均值。

1.2.6 qRT-PCR实验 将需要检测的细胞提取总RNA并反转录为cDNA,再以此为模板按照qRT-PCR试剂盒要求操作,检测模板中miR-33b的表达情况。结果计算,以U6为内参,2-△△Ct法计算miR-33b的相对表达水平。miR-33b上游引物5′-TGTCAGGCAACCGTATTCACC-3′,下游引物5′-CATGCAGTGAGTTAGATGTAGAACGTGCATTGCTGT-3′;U6上游引物5′-ATACAGAGAAAGTTAGCACGG-3′,下游引物5′-GGAATGCTTCAAAGAGTTGTG-3′。

1.3 统计学处理

实验中所涉及的所有数据均使用SPSS 22.0分析,计量数据用均数±标准差的方式表示。多组间数据比较采用单因素方差分析+LSD-t检验,两组间数据比较采用独立样本t检验,差异具有统计意义用P<0.05表示。

2 结果

2.1 不同浓度安罗替尼对宫颈癌细胞HeLa增殖抑制的影响

结果如图1、表1所示,与NC组相比,安罗替尼(4、8、16、32 μmol/L)对HeLa细胞的抑制率呈浓度依赖性增强(P<0.05)。因16 μmol/L安罗替尼对HeLa细胞的抑制率接近半数抑制率,故选用该浓度用于后续实验研究。

图1 Western blot检测CyclinD1蛋白的相对表达

表1 不同浓度安罗替尼对宫颈癌细胞HeLa增殖抑制的影响

2.2 安罗替尼对宫颈癌细胞HeLa迁移和侵袭的影响

结果如图2和表2所示,与NC组相比,安罗替尼(16 μmol/L)处理的HeLa细胞中MMP2、MMP9的蛋白表达均显著降低,迁移细胞数和侵袭细胞数均显著降低(P<0.05)。

注:A:transwell检测细胞迁移和侵袭,B:Western Blot检测MMP2、MMP9蛋白的表达。

表2 安罗替尼对宫颈癌细胞HeLa迁移和侵袭的影响

2.3 安罗替尼对miR-33b表达的影响

与NC组miR-33b表达量(1.00±0.11)相比,安罗替尼组细胞中miR-33b表达量(3.96±0.40)显著升高(t=21.405,P<0.05)。

2.4 miR-33b对宫颈癌细胞HeLa增殖、迁移和侵袭的影响

结果如图3和表3所示,与miR-NC组相比,miR-33b组细胞中miR-33b表达显著升高,CyclinD1、MMP2、MMP9的蛋白表达均显著降低,细胞的增殖抑制率显著升高,迁移细胞数和侵袭细胞数均显著降低(P<0.05);与anti-miR-NC组相比,anti-miR-33b组细胞则发生相反的变化。

注:A:transwell检测细胞迁移和侵袭情况,B:Western blot检测CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白的表达情况。

表3 miR-33b对宫颈癌细胞HeLa增殖、迁移和侵袭的影响

2.5 低表达miR-33b在安罗替尼对宫颈癌细胞HeLa增殖、迁移和侵袭影响中的逆转作用

结果如图4和表4所示,与安罗替尼+anti-miR-NC组相比,安罗替尼+anti-miR-33b组细胞中miR-33b表达显著降低,CyclinD1、MMP2、MMP9的蛋白表达均发生明显升高,增殖抑制率显著降低,迁移细胞数和侵袭细胞数均显著升高(P<0.05)。

注:A:transwell检测细胞迁移和侵袭,B:Western Blot检测CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白的表达。

表4 低表达miR-33b在安罗替尼对宫颈癌细胞HeLa增殖、迁移和侵袭影响中的逆转性

2.6 PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达

结果如图5和表5所示,与NC组相比,安罗替尼组细胞中p-PI3K、p-AKT的蛋白表达均显著降低。与安罗替尼+anti-miR-NC组相比,安罗替尼+anti-miR-33b组细胞中p-PI3K、p-AKT的蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。

图5 Western blot检测p-PI3K、p-AKT蛋白的表达

表5 PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达

3 讨论

安罗替尼是一种多目标受体酪氨酸激酶抑制剂,在妇科癌症中具有潜在的FGFR抑制作用和抗血管生成活性[6]。在美国的Ⅰb期复发性或持续性卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌的临床剂量研究中显示,每日单次服用12 mg,每2周开方/1周关闭的方案时,该药耐受性良好[7]。据报道,安罗替尼能够抑制甲状腺癌细胞的活力,并阻滞细胞周期的G2/M期,在体内还可抑制小鼠异种移植甲状腺肿瘤的生长,揭示安罗替尼在甲状腺癌中的抗肿瘤活性[8]。本研究发现,安罗替尼能够抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭,这与前辈们关于安罗替尼抗癌功能的实验结果相吻合,为安罗替尼在宫颈癌中的临床应用提供了实验支持。进一步研究发现,安罗替尼可明显上调宫颈癌细胞中miR-33b的表达,猜测miR-33b可能参与了安罗替尼的抗癌功能。

miR-33b是miR-33家族的成员,在多种癌症中起着抑癌作用[9,10]。Zhai等[11]在研究中发现,miR-33b在非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)组织和细胞系中下调,与细胞增殖和集落形成增加有关,过表达miR-33b能够抑制癌细胞的增殖、集落形成并诱导细胞周期停滞和凋亡并抑制癌细胞的葡萄糖代谢,其机制与乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)。据报道,miR-33b在胆囊癌细胞中表达异常降低,并且上调miR-33b能够增加E-钙粘蛋白的水平,降低N-钙粘蛋白和波形蛋白的水平,这与细胞增殖、迁移、侵袭、EMT和肿瘤生长受阻有关,究其机制这与miR-33b靶向睫状小根卷曲螺旋蛋白(ciliary rootlet coiled coil protein,CROCC)相关[12]。据报道,在胰腺癌中miR-33b可作为长的非编码RNA(lncRNA)分化拮抗非蛋白编码RNA(differentiation antagonizing nonprotein coding RNA,DANCR)的靶标,还可靶向抑制下游的MMP16基因,调控胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化,对胰腺癌的治疗提供了新的策略[13]。本实验发现,过表达miR-33b能够抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭,而抑制miR-33b则具有相反的作用,这说明miR-33b在宫颈癌中也具有潜在的治疗价值。

PI3K/AKT信号通路是重要的信号转导通路,参与调控细胞增殖、凋亡和分化等过程,在肿瘤的发生发展中发挥重要作用[14]。研究显示,miR-489通过靶向调节X-连锁的凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)并抑制PI3K/AKT和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)信号通路来抑制卵巢癌的发展[15];下调芳香烃受体核易位蛋白2(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator like 2,ARNTL2)可通过抑制PI3K/AKT信号通路降低结肠癌细胞增殖和迁移[16]。本研究发现,安罗替尼能够抑制宫颈癌细胞中PI3K/AKT信号通路的活性,并且抑制miR-33b能够部分逆转安罗替尼对宫颈癌细胞中PI3K/AKT信号通路的抑制作用。这说明了PI3K/AKT信号通路的活性受miR-33b和安罗替尼的调控,也说明了miR-33b与安罗替尼在抗宫颈癌中的相互关系,为安罗替尼在宫颈癌治疗中的价值提供理论支持,但不足的是,缺乏动物体内的实验支持。

综上所述,安罗替尼可抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭,其机制与上调miR-33b,抑制PI3K/AKT信号通路活性有关,为安罗替尼在宫颈癌中的临床应用奠定了基础。

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