光照强度对丝状藻去除再生水中氮磷的影响

杨宇航，边雪强，孙翠竹，姜晓华，单 欣，李锋民,3*

1. 中国海洋大学环境科学与工程学院近海环境污染控制研究所，山东 青岛 2661002. 中国海洋大学，海洋环境与生态教育部重点实验室，山东 青岛 2661003. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室，海洋生态与环境科学功能实验室，山东 青岛 266071

由于人口增长、经济发展和消费模式的转变，全球用水量仍在以每年约1%的速度稳步增长，到2030年世界可能面临40%的水资源短缺[1]. 我国水资源总量虽占世界水资源总量的6%左右，但由于我国人口多且分布不均，人均水资源量严重不足[2]，我国缺水城市超过1/2，严重缺水城市超过1/3[3]. 污水的再生利用是解决我国水资源短缺和水污染问题的重要途径，然而与常规水资源相比，再生水中高浓度的N和P可导致藻华暴发[4]，对水质、景观和生态功能产生显著的负面影响[5]. 王怡等[6]研究发现，完全达标的再生水在夏季静置4 d后会爆发藻华，藻密度可达8.08×105cells/mL，因此在再生水回用前，有必要对再生水进行深度脱氮除磷处理[7-8].

常规的再生水深度处理方法，如微滤、超滤等物理方法，虽然可以有效净化再生水，但成本较高，且无法实现氮、磷元素的回收利用，造成资源浪费[9]. 相比之下，藻类可以通过光合作用吸收氮、磷等营养盐，并转化为藻类生物质，可作为生物柴油、饲料、沼气等产品的原料，兼顾环境效益和经济效益. 目前，小球藻、栅藻等藻体较小的微藻已被用于处理包括再生水在内的各种污水[10-11]. 但微藻细胞体积小，收集困难[12]，增加了污水处理成本[13]，研究表明微藻的收集占设备成本的90%以上，占总成本的20%～30%[14].

与微藻相比，丝状藻具有易捕捞和抵抗高营养级生物捕食的优势. 利用丝状藻进行废水处理的主要方法分为藻类草皮洗涤器(ATS)和藻类单一培养.ATS系统已被用于处理农业、水产养殖、乳制品和初级生活污水[15-16]. 与ATS相比，藻类单一培养的主要优势在于可以收获单一的丝状藻类，控制生物质的质量，以便于回收利用[17]. 然而目前一些关键参数如光照强度，对丝状藻单一培养及脱氮除磷的影响仍不清楚[18]. 因此，该研究探究了不同光照强度对4种丝状藻去除再生水中氮、磷的影响以及与丝状藻生物质产量、蛋白质含量、脂质含量的关系，以期为应用丝状藻深度处理再生水及藻类的资源化提供数据支持.

1 材料与方法

1.1 藻种培养

试验所用的4种丝状藻，即水绵(Spirogyrasp.，FACHB-737)、结 节 鞘 藻(Oedogoniumnodulosum，FACHB-996)、丝藻(Ulothrixsp.，FACHB-494)和转板藻(Mougeotiasp.，FACHB-718)，均购自中国科学院淡水藻种库. 其中，水绵和结节鞘藻在BG11培养基中培养；丝藻和转板藻在SE培养基中培养. 培养条件为温度25 ℃、光照强度2000 lx、光暗比12 h∶12 h.

1.2 研究方法

试验在装有5 L再生水的高为31 cm、直径为19 cm的玻璃容器中进行，使用额定功率为18 W的T5 LED节能灯进行光照，试验设置5组光照强度(0、2000、6000、8000、10000 lx)，每组设置3个平行.试验前将藻种于试验水体中驯化培养7 d，每个试验组初始接种0.25 g (鲜质量)驯化后的丝状藻. 为避免实际再生水水质不稳定产生的误差，试验所用再生水为实验室配置再生水，主要成分为0.058 g/L NaNO3、0.017 g/L NH4Cl、0.046 g/L C6H12O6·H2O、0.002 g/L KH2PO4、0.007 g/L CaCl2、0.0001 g/L FeCl3、0.007 g/L MgSO4、微量元素〔0.572 mg/L H3BO3、0.372 mg/L MnCl2·4H2O、0.044 mg/L ZnSO4·7H2O、0.078 mg/L Na2MoO4·2H2O、0.016 mg/L CuSO4·5H2O、0.01 mg/L Co(NO3)2·6H2O〕. 所有试验组在25 ℃、光暗比12 h∶12 h的条件下培养. 试验周期为16 d，每4 d取水样100 mL测定水样TN、、TP浓度及藻类生物质产量. 第16天将全部藻体滤出，使用超纯水冲洗，冷冻干燥后测定藻细胞内脂质和蛋白质含量.

1.3 分析测试方法

1.3.1 水质测定方法

水样使用0.45 μm的玻璃纤维滤膜过滤，测定水中TN、、TP浓度，其中TN浓度采用《水质 总氮的测定 碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》(HJ 636—2012)，浓度采用《水质 氨氮的测定 纳式试剂分光光度法》(HJ 535—2009)测定，浓度采用《水质 硝酸盐氮的测定 紫外分光光度法》(HJ/T 346—2007)测定，TP浓度采用《水质 总磷的测定 钼酸铵分光光度法》(GB/T 11893—1989)测定.

1.3.2 生物质产量测定方法

使用预先烘干至恒质量的玻璃纤维滤膜过滤水样，过滤后的滤膜在60 ℃烘干24 h至恒质量，计算生物质产量(M)，其计算公式：

式中：M为生物质产量，g/L；m0为过滤烘干后的滤膜质量，g；m1为预先烘干的滤膜质量，g；V为再生水体积，L.

1.3.3 脂质、蛋白质含量的测定方法

冷冻干燥后的丝状藻在液氮中研磨成粉，使用Solarbio公司的蛋白质提取试剂盒对藻细胞中的蛋白质进行提取，离心取上清液，用Bradford法测定上清液中蛋白质的含量. 脂质的提取和测定参考HY/T 231—2018《藻类总脂的提取和测定》，研磨后的藻粉用体积比为2∶1的甲醇与氯仿混合溶液提取脂质，离心取上清液，在上清液中加入1%的NaCl溶液和氯仿，萃取出底部有机相，使用氮气吹干后称量测定[19].

1.3.4 藻类N、P浓度的测定方法

称取一定量冷冻干燥后的丝状藻，加入超纯水后分别使用过硫酸钾、碱性过硫酸钾溶液消解，参考水中TP、TN浓度的测定方法进行测定.

1.4 数据分析

用Excel 2018软件进行数据处理，用Origin 2018软件进行绘图，使用SPSS软件进行均值检验分析，P＜0.05表示差异显著，P＞0.05表示无显著差异.

2 结果与分析

2.1 光照强度对丝状藻去除氮磷的影响

2.1.1 光照强度对丝状藻去除TN的影响

再生水中TN浓度的变化趋势如图1所示. 以水绵为例，第16天，随光照强度增加，其对TN的去除率先升后降. 光照强度为8000 lx时，水绵对TN的去除效果最好，再生水中TN浓度从初始的18.32 mg/L降至9.47 mg/L，去除率为48.34%；当光照强度为10000 lx时，水绵对TN的去除效果降低，再生水中TN浓度降至9.54 mg/L，去除率为47.95%；当光照强度为2000和6000 lx时，水绵对TN的去除效果最差，再生水中TN浓度分别为12.11、12.05 mg/L，去除率分别为33.93%、34.22%. 光照强度对结节鞘藻、丝藻和转板藻去除TN的影响规律与水绵一致，当光照强度为8000 lx时，其对TN的去除效果最好，第16天，再生水中TN浓度分别降至6.44、9.21、3.79 mg/L，去除率分别为64.87%、49.74、79.32%. 当光照强度为2000和6000 lx时，水绵、结节鞘藻、丝藻和转板藻对TN的去除效果均最差.

图1 光照强度对丝状藻去除再生水中TN浓度的影响Fig.1 Effect of light intensity on TN removal from reclaimed water by filamentous algae

图2 光照强度对丝状藻去除再生水中NO3−-N浓度的影响Fig.2 Effect of light intensity on NO3—-N removal from reclaimed water by filamentous algae

图3 光照强度对丝状藻去除再生水中NH4+-N浓度的影响Fig.3 Effect of light intensity on NH4+-N removal from reclaimed water by filamentous algae

2.1.4 光照强度对丝状藻去除TP的影响

再生水中TP浓度的变化趋势如图4所示. 光照强度为2000和6000 lx时，水绵对TP的去除效果较差，第16天，再生水中TP浓度分别为0.29、0.28 mg/L，去除率分别为42.63%、43.72%，无显著差异(P＞0.05)；当光照强度为8000和10000 lx时，水绵能有效地去除TP，当去除率大于90%时，去除速率分别为0.03、0.04 mg/(L·d). 结节鞘藻和转板藻在光照强度为2000、6000、8000和10000 lx时均能有效地去除TP，当去除率大于90%时，去除速率分别为0.03、0.03、0.06、0.04和0.04、0.04、0.11、0.06 mg/(L·d). 光照强度为2000 lx时，丝藻对TP的去除效果也较低，去除率为55.78%；当光照强度为6000、8000和10000 lx时，丝藻能有效去除TP，当去除率大于90%时，去除速率分别为0.04、0.06、0.04 mg/(L·d).

图4 光照强度对丝状藻去除水中TP浓度的影响Fig.4 Effect of light intensity on TP removal from reclaimed water by filamentous algae

2.2 光照强度对丝状藻生长的影响

2.2.1 光照强度对丝状藻生物量的影响

4种丝状藻生物质产量如图5所示. 由图5可见，黑暗条件下4种丝状藻生物质产量变化趋势一致，均为0～4 d升高，然后缓慢降低. 对于水绵，随光照强度的增加，其生物质产量先升后降. 当光照强度为8000 lx时，水绵生物质产量最高，为0.71 g/L；当光照强度为2000、6000 lx时，水绵生物质产量均较低，均为0.016 g/L；当光照强度进一步提至10000 lx时，水绵生物质产量降至0.52 mg/L. 同样，对于结节鞘藻和丝藻，当光照强度为8000 lx时，其生物质产量均最高，第16天，其生物质产量分别为1.02 和1.03 g/L；当光照强度为10000、6000、2000 lx时，第16天，其生物质产量分别为0.06、0.43、0.32 g/L和0.86、0.64、0.17 g/L. 此外，当光照强度为8000 lx时，丝藻生物质产量在第12天达到最大，然后降低. 对于转板藻，其生物质产量随光照强度的增加而增加，分别为0.48、0.54、0.84、0.88 g/L.

图5 光照强度对丝状藻生物质产量(以干质量计)的影响Fig.5 Effects of light intensity on biomass production (DW) of filamentous algae

2.2.2 光照强度对丝状藻细胞内蛋白质和脂质含量的影响

不同光照强度下丝状藻细胞内蛋白质和脂质的含量如图6所示. 当光照强度为8000 lx时，4种丝状藻细胞内蛋白质含量最高，分别为23.52%、44.36%、43.76%、39.65%；当光照强度为6000 lx时，4种丝状藻细胞内蛋白质含量最低，分别为14.21%、14.72%、20.56%、16.00%. 当光照强度为8000 lx时，水绵、结节鞘藻和丝藻细胞内的脂质含量最高，分别为22.62%、23.66%、15.07%、17.49%，其他光照强度下这3种丝状藻细胞内脂质含量随着光照强度的增加而降低.

图6 光照强度对丝状藻蛋白质和脂质含量的影响Fig.6 Effects of light intensity on protein and lipid contents of filamentous algae

2.2.3 光照强度对丝状藻吸收N、P的量的影响

不同光照强度条件下，丝状藻吸收的N、P量及其占比如表1所示. 随光照强度的上升，4种丝状藻吸收N的量及其占比先升高后降低，在光照强度为8000 lx时最高，此时水绵、结节鞘藻、丝藻和转板藻吸收N量的占比最高，分别为51.48%、44.72%、55.75%、46.67%. 藻类吸收的P量及其占比与水中P的减少量呈正相关，当光照强度为2000和6000 lx时，水绵、结节鞘藻对P吸收量的占比均较低，其他试验组中丝状藻吸收P量的占比均大于50%.

表1 丝状藻吸收的N、P量及其占比Table 1 N and P absorption of filamentous algae and its proportion

3 讨论

光照强度是影响藻类光合作用及生长的重要因素，与藻类对N、P等的去除直接相关，并且当光照强度过高时会对藻类生长产生光抑制[20]. 该研究表明，随光照强度升高，水绵、结节鞘藻和丝藻的生物质产量及NH4+-N去除率逐渐升高，并在8000 lx时达到最大值，但随光照强度进一步升至10000 lx时，其生物质产量和NH4+-N去除率均降低，这说明3种丝状藻的光饱和度为8000 lx，而在10000 lx时产生了光抑制，但转板藻在10000 lx时未发现光抑制现象，说明转板藻的光饱和强度大于8000 lx.

4种丝状藻对TN的去除效果从高到低依次为转板藻、结节鞘藻、丝藻、水绵. 除转板藻外，其他3种丝状藻处理后的再生水中仍残留较高浓度的TN，并以为主，这是因为藻类光合作用可直接同化而在同化前需要在细胞质中还原为然后在叶绿体中进一步还原为因此是藻类光合作用吸收的优先氮源[21]. 这也导致的去除与藻类生物质产量相关，低光照强度时，水绵(2000、6000 lx)和丝藻(2000 lx)较低的生物质产量导致的去除率较低. 此外，甚至会抑制藻类对的吸收，Yin等[22]研究发现，弱光条件下对硅藻吸收的抑制效应更强. 然而在该研究中，当光照强度为6000 lx时，4种丝状藻对的去除效果均最好，说明在高光照强度时对丝状藻吸收的抑制作用更强. 当光照强度为2000和6000 lx时，水中浓度的变化趋势与黑暗组相似，说明0～4 d水中浓度的变化并不完全是藻类光合作用导致的，还包括细菌的硝化/反硝化作用[18]，在此过程中微藻光合作用产生的氧气可被细菌用于有机物的氧化，而细菌产生二氧化碳可被微藻利用而产生氧气[23].从表1可以看出，藻类吸收N的量仅占整个体系的7.17%～66.47%. 水绵和鞘藻是两种已被用于深度处理再生水的丝状藻，Neveux等[24]研究发现，鞘藻对TN的去除率为61%，与该研究结果基本一致. 但Ge等[25]通过水绵深度处理污水处理厂二级出水，发现其对TN的去除率达82.2%，高于该研究结果，这是由于该试验所配再生水中磷含量较低，N/P为66.43，磷含量过低限制了藻类在再生水中的生长及其对N的吸收. 与水绵和结节鞘藻相比，丝藻与转板藻是两种尚未在其他研究中被用于污水处理的藻属，且转板藻对TN的去除效果优于其他3种丝状藻，而丝藻的去除效果优于水绵，低于结节鞘藻，因此转板藻更适合用于深度去除再生水中的N.

丝状藻能有效去除再生水中的P. 藻类对P的吸收与藻类生物质产量有关[26]，与NH4+-N浓度的变化规律相似，低光照强度下水绵(2000、6000 lx)和丝藻(2000 lx)对TP的去除率均较低，且在试验后期藻类死亡导致再生水中的TP浓度增加. 饱和光照强度时，虽然丝状藻对TP的去除率未显著高于其他光照组，但提高了丝状藻对TP的去除速率. 0～4 d，再生水中TP的去除速率最高，这是因为藻类对P的吸收存在奢侈吸收现象[20]，即藻类会在前期过量吸收P并以多聚磷酸盐的形式储存于细胞体内，用于保证当外界P不足时藻类的正常生长发育，因此当水中TP浓度降至不变后，藻类仍能进行生物质生产. 对于低光照强度时，水绵和丝藻试验组在4～8 d观察到再生水中TP浓度升高，这可能是部分P的不稳定吸附作用所导致的[12]. 当光照强度较低时，水绵、丝藻前期生长缓慢，出现P释放现象；而结节鞘藻、转板藻及高光照强度下的水绵、丝藻生物质产量在试验前期迅速升高，所以未出现P释放. 从表1也可以看出，在光照强度为2000和6000 lx时，水绵、结节鞘藻对P的吸收占比较低，其他试验组中丝状藻吸收P的占比均大于50%，因此藻类吸收是再生水中P的主要去除途径. 与微藻相比[9]，丝状藻体积的增大并不影响其对P的去除，除水绵和丝藻在低光照强度下对TP的去除率较低外，其他条件下4种丝状藻均能有效去除再生水中的P，去除率均在90%以上，水中P浓度可降至0.1 mg/L，达到我国GB 3838—2002《地表水环境质量标准》Ⅱ类水质标准.

再生水中培养的丝状藻细胞内蛋白质含量高于脂质含量. 藻类会将同化后70%～90%的N进一步转化为蛋白质[27]. 当光照强度为8000 lx时，4种丝状藻内蛋白质含量最高，此时藻类吸收更多的N，导致蛋白质含量也随之升高. 尽管水绵已被用于处理各种污水[28-29]，但该研究发现，水绵对再生水中的TN去除率、TP去除率、生物质产量、蛋白质含量均低于其他3种丝状藻. 当光照强度为8000 lx时，结节鞘藻、丝藻和转板藻细胞体内蛋白质含量均大于40%，远高于已有研究中的丝状藻，如Cole等[30]在ATS污水处理系统中所培养的丝状藻蛋白质含量仅为18%；张婷[31]研究了4种不同橘色藻科丝状藻中的蛋白质含量，结果表示，蛋白质含量为7.48%～10.40%. 当藻类处于最佳光照强度时，叶绿体中光和系统PSⅡ中的捕光色素蛋白复合物对光能的吸收最大[32]，促进细胞体内有机物的合成，因此当光照强度为8000 lx时，水绵、结节鞘藻、丝藻内脂质含量最高，而其他条件下，随光照强度的增加，藻细胞体内脂质含量降低. 这与已有研究结果相似，如薛瑞萍等[33]研究发现，当光照强度为60 μmol/(m2·s)时，硅藻细胞内脂质含量最高，而其他光照条件下，脂质含量随光照强度的升高而降低，这可能是因为低光照强度下更有利于不饱和脂肪酸(PUFA)的积累[34-35]. 与其他用于产油的丝状藻相比[19]，4种于再生水中培养的丝状藻脂质含量(9.43%～23.66%)较低，这是再生水中低C/N所导致的. Sun等[36]认为，当COD/TN低于8时，对于藻类而言为低C/N水体，而C骨架不足导致了藻细胞体内的脂质含量较低. 因此使用丝状藻去除再生水中的N、P并将其转化为蛋白质的资源化利用潜力更高.

4 结论

a) 除水绵、丝藻在低光照强度时TP的去除率较低外，其他试验组均能有效地去除再生水中的TP，因此丝状藻对再生水的脱氮除磷能力更多取决于其对TN的去除能力，从高到低依次为转板藻、结节鞘藻、丝藻、水绵.

b) 水绵、结节鞘藻和丝藻的生物质产量、蛋白质含量和脂质含量均在光照强度为8000 lx时达到最高，表明其光饱和强度均为8000 lx；转板藻在光照强度为10000 lx时生物质产量最高，但此时其蛋白质和脂质含量却低于光照强度为8000 lx时，表明转板藻的光饱和强度在8000～10000 lx之间.

c) 再生水中培养的丝状藻，其体内蛋白质含量高于脂质含量，因此利用丝状藻去除再生水中的N、P并将其转化为蛋白质的资源化利用前景更好.