葆青颗粒治疗卵巢储备功能下降作用机制的网络药理学研究

林光耀，叶涛，张米佳，冯勋，甯海燕，王永周

(1. 西南医科大学附属中医医院妇科，四川 泸州 646000；2. 四川省内江市中医医院心内科，四川 内江 641000)

卵巢储备功能下降(diminished ovarian reserve，DOR)是以月经紊乱、不孕以及复发性流产等为主要临床表现的妇科常见内分泌疾病，常伴随血清卵泡刺激素水平(follicle stimulating hormone ，FSH)升高，抗苗勒管激素( anti-Müllerian hormone，AMH) 和雌激素(estrogen，E2)水平下降[1]。近年，DOR的发生率从19%逐渐上升至26%，在不孕人群中的发病率更是高达64%[2-3]，若缺乏及早治疗，则会进展为不可逆的卵巢早衰状态[4]。目前，尽管激素替代疗法(hormone replacement therapy，HRT)作为治疗DOR的首选方式，在改善患者潮热、盗汗、月经失调等方面效果显著，但长期的HRT应用也会增加患深静脉血栓、卵巢癌和乳腺癌等风险[5-6]。一项纳入198位绝经前女性和172位绝经后女性平均年龄(42.7±13.8岁)的研究显示，服用激素类药物会显著增加绝经前女性患静脉血栓(OR=0.79，95%CI：0.67～0.96)、抑郁(OR=0.80，95%CI：0.69～0.92)和宫颈癌(OR=0.74，95%CI：0.52～0.97)的风险，而对于绝经后女性则表现为体重增加(OR=1.24，95%CI：1.07～1.42)和较高患卵巢癌(OR=1.44，95%CI：1.19～1.75)的风险[7]。故对DOR的治疗成为困扰妇科同仁们的难题之一。因此，寻找疗效显著且更安全的治疗方法，一直是亟需解决的热点问题。

中医学根据DOR的典型临床表现，将此病纳于“血枯”“不孕症”和“闭经”等范畴，论其治法多以补肾填精为要[8]。在《景岳全书》中作为益精填髓兼具补肾滋阴之效的代表方左归丸，在妇科诸疾中运用广泛且疗效肯定，为后世医家广为借鉴[9]。葆青颗粒作为妇科应用于临床多年的院内制剂，此方以滋肾填精为立方依据，在左归丸的基础上进行精简化裁，最终以熟地、山药、山茱萸、菟丝子、枸杞子、五味子、肉苁蓉、龙骨八味中药组成。本课题组通过长期临床观察发现，葆青颗粒能明显调节女性性激素水平，在治疗由围绝经期激素变化引起潮热、失眠和眩晕等效果更是优于雌激素药物(尼尔雌醇)，且无恶心、呕吐、头晕、乳房胀痛以及突破性出血等不良反应(P<0.05)[10]；对子宫切除后的绝经前患者服用葆青颗粒治疗3个月，随访1年的结果发现，与接受克龄蒙治疗组相比，两组患者Kupperman评分和FSH水平均升高，并伴随孕激素水平下降(P<0.05)，但组间治疗效果比较无差异(P>0.05)，同时不良反应也显著低于克龄蒙治疗(P<0.05)[11]，提示葆青颗粒与激素类药物治疗效果类似，在由药物引起的不良反应方面更是低于激素类药物。DOR与妇科术后患者出现肾虚精亏和一系列绝经前后诸证的临床表现极为相似，故结合中医“异病同治”理论，我们亦将葆青颗粒运用于临床治疗DOR患者，疗效斐然，但其具体作用机制仍待进一步阐述。故本文通过借助网络药理学方法，探究葆青颗粒治疗DOR的作用机制及起效靶点，以期为葆青颗粒的临床运用提供理论依据，同时亦为我们课题组对葆青颗粒的后续深入研究奠定科学基础。

1 材料与方法

1.1 葆青颗粒活性成分及靶点收集 分别以葆青颗粒所含的8味中药(熟地、山药、山茱萸、菟丝子、枸杞子、五味子、肉苁蓉、龙骨)为关键词，通过TCMSP平台进行检索，得到葆青颗粒所含的活性成分及潜在靶点，其中根据药代动力学参数，分别设定口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%同时类药性(drug-likeness，DL)≥0.18为本研究的筛选条件，最后借助Uniprot蛋白数据库标准化匹配葆青颗粒对应的靶点。本研究中的五味子限定为北五味子进行数据库的检索，由于龙骨在以上数据库中未检索出任何活性成分结果，故本研究着重以剩余7味中药为研究对象。

1.2 DOR相关靶点收集 以diminished ovarian reserve为关键词，分别通过Genecard和OMIM数据库对DOR疾病所检索出的基因靶点进行收集汇总，合并重复的检索结果。

1.3 化合物-靶点-疾病网络构建及分析 利用R语言绘制韦恩图展示葆青颗粒的作用靶点与DOR疾病靶点的交集。通过Cytoscape软件对葆青颗粒所含化合物及潜在靶点的关系进行可视化研究，从而构建以“化合物-靶点-疾病”为核心的互作网络。网络中各节点连接线路的数量用度值表示，度值的大小被用于评价葆青颗粒所含的主要化合物和靶点。最后将以上所提取出的交集靶点一次性导入至STRING数据库，同时设定限定物种类型为人，并将默认值≥0.4作为蛋白间互作分值过滤条件，得到蛋白互作网络(PPI)图，并用柱状图对核心靶点进行汇总。

1.4 GO生物功能与KEGG信号通路富集分析 利用R语言将葆青颗粒治疗DOR的交集靶点转换为Gene ID，随后行GO和KEGG通路富集分析，同时以P<0.05纳入条件，最后使用Perl语言将富集结果按从高到低顺序整理，将排名为前20条的结果用气泡图展示。

2 结果

2.1 葆青颗粒化合物-DOR靶点-疾病网络构建 首先通过TCMSP平台共计检索出葆青颗粒所含化合物成分有795种，其中熟地活性成分有76种。山药活性成分有71种；山茱萸活性成分有226种；菟丝子活性成分有29种；枸杞子活性成分有188种；五味子活性成分有130种；肉苁蓉活性成分有75种。然后结合OB≥30%同时DL≥0.18作为本研究的筛选条件，初步获得熟地活性成分有2个、山药活性成分有16个、山茱萸包活性成分有20个、菟丝子活性成分有11个、枸杞子活性成分有45个、五味子活性成分有8个、肉苁蓉活性成分有6个；合并并删除无对应治疗DOR作用靶点的活性成分60个，最终获得葆青颗粒有效活性成分34个，其中槲皮素(Quercetin)为枸杞子、肉苁蓉和菟丝子共有成分；β-谷甾醇(Beta-sitosterol)为枸杞子、肉苁蓉、山茱萸和菟丝子共有成分；豆甾醇(Stigmasterol)为枸杞子、山药、山茱萸和熟地黄共有成分；亚油酸乙酯(Mandenol)为枸杞子和山茱萸共有成分；异岩藻甾醇(Isofucosterol)为山药和菟丝子共有成分；谷甾醇(Sitosterol)为山茱萸和熟地黄共有成分。接着通过TCMSP查询得到34个活性成分对应231个靶点。最后基于Genecard和OMIM数据库，通过取并集共获得DOR疾病靶点1 288个，绘制韦恩图得到130个交集靶点，葆青颗粒(BQKL)和DOR分别用绿色和红色表示(见图1)。取葆青颗粒与DOR疾病共有靶点130个绘制“药物-靶点-疾病”网络图(见图2)。

图1 葆青颗粒与DOR靶点韦恩图

DOR：卵巢储备功能下降；BQKL：葆青颗粒；SY：山药；SZY：山茱萸；TSZ：菟丝子；GQZ：枸杞子；WWZ：五味子；RCR：肉苁蓉；A：槲皮素；B：β-谷甾醇；C：豆甾醇；D：亚油酸乙酯；E：异岩藻甾醇；F：谷甾醇。

2.2 PPI网络构建及共同靶点筛选 将130个交集靶点一次性导入至STRING数据库构建PPI网络，结果包含130个节点和2 380条互作关系连线，Degree平均值为36.6(见图3)。取PPI网络图中连接度位于前30的靶点作为葆青颗粒核心靶点，主要包括蛋白激酶 B(protein kinase B，AKT-1)、白介素6(interleukin 6，IL-6)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)等。提示以上靶点可能为治疗DOR的关键靶点(见图4)。

图3 葆青颗粒治疗DOR构建的PPI网络

图4 葆青颗粒治疗DOR的核心靶点

2.3 GO生物功能与 KEGG信号通路富集分析 将葆青颗粒与DOR疾病的共有靶点130个输入到R语言完成富集分析并通过气泡图对结果进行表达，图中气泡节点越大表明获得相关结果数量越多，气泡的颜色由P值大小决定。由图5可知，GO生物功能富集所得排名前20的结果主要涉及有整联蛋白结合(integrin binding)和生长因子受体结合(growth factor receptor binding)等；由图6可知，KEGG通路富集所得排名前20的结果主要涉及有糖尿病并发症AGE-RAGE通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流体剪切应力与老年性硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、IL-17信号通路(interleukin-17 signaling pathway)、HIF-1信号通路(hypoxia-inducible factor 1 signaling pathway)和TNF信号通路(TNF signaling pathway)等。

图5 葆青颗粒治疗DOR靶点基因GO功能富集图

图6 葆青颗粒治疗DOR靶点基因KEGG功能富集图

3 讨论

中医经典古籍对DOR疾病颇有丰富认识，如傅山在《傅青主女科》所载：“经水早断，似乎肾水衰涸”乃年未老经水断的病因之所在；又如萧壎在《女科经纶》中认为痰湿滞于胞宫，精血难聚，加之血少难以摄精，胞孕失养乃DOR所致不孕的重要病机；此外陈自明在《妇人大全良方》中提出月经宣利的基础为妇人肾气充盛，冲任通利，经血满盈的独到见解。故在治疗DOR时应尤为重视滋肾填精之法[12]。葆青颗粒方中重用熟地黄为君药，意达补益肾精兼养血之妙；山药、山茱萸、菟丝子、枸杞子共为臣药，以助熟地黄滋补阴血，同时调肝益肾；五味子协龙骨固精宁心，心肾相交；最后少许肉苁蓉，以达“阳中求阴”之意。独具匠心的配伍以上诸药使葆青颗粒滋肾填精，养阴益血之力斐然。此方归纳有如下特点：①以滋肾填精为药物配伍特点，又兼养阴益血配以补肾宁心，针对DOR患者“肾水衰涸”表现恰好药证相符；②此方由经典的左归丸化裁而成，在滋阴补肾的同时兼填精益髓之效，体现了“阴得阳升而泉源不竭”思想。

通过筛选获得葆青颗粒中治疗DOR的主要化学成分有槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、亚油酸乙酯、异岩藻甾醇和谷甾醇等，提示以上成分可能在治疗DOR时发挥关键作用。其中槲皮素能显著改善卵巢储备功能，调节性激素分泌，同时还能提高卵泡的质量，抑制颗粒细胞凋亡等特点[13]。黄长盛等[14]通过对卵巢早衰大鼠连续灌胃槲皮素30 d后发现，同模型组比较，槲皮素干预组大鼠卵巢内各级卵泡和黄体数明显增多，E2和AMH水平增高，并伴随LH和FSH水平下降。β-谷甾醇也可作用于卵巢颗粒细胞提升E2水平，并且有助于改善因低雌激素水平而伴随的骨量丢失[15-16]。另外，炎性因子如IL-6、IL-17和TNF可促进DNA裂解和卵泡闭锁，并影响原始卵泡发育，故通过降低血清炎性因子含量，抑制卵巢内炎症反应而改善卵巢功能及提高生育能力[17-18]。正常的月经周期与卵泡和黄体功能的关系密不可分，而血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可通过调控卵巢血管生成、提高血管通透性，进而影响优势卵泡数量，同时参与卵巢颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁过程，另外亦对排卵后黄体的形成和维持其功能发挥着重要作用，诸多研究证实HIP-1信号通路正是调控卵巢中黄体VEGF表达的关键，与本研究结果一致[19-20]。以上均表明，葆青颗粒治疗DOR的生物学机制可能涉及多成分和多途径的复杂过程。

本研究共检索出葆青颗粒治疗DOR的活性成分51个，作用于DOR的靶点共130个；通过“药物-靶点-疾病”图直观地体现出葆青颗粒治疗DOR拥有多成分与靶点的特点；同时利用PPI网络图筛选出上述靶点中的核心靶点；最后以GO与KEGG信号通路富集分析得出参与葆青颗粒治疗DOR的重要生物过程和一系列信号通路。由此可见，本研究结果具有较好的科学性、可靠性和精准性，提示葆青颗粒可能通过调节性激素水平、改善卵巢血液循环，并抑制炎性因子形成和颗粒细胞凋亡，从而起到治疗DOR的作用。虽然本研究对葆青颗粒治疗DOR提供了理论依据，但其具体作用机制仍需我们课题组围绕本研究结果开展深入的基础实验进行验证[21]。