基于H9C2细胞株的ADRB1基因多态性稳定过表达模型的构建

陈丽萍，肖婷，邓懋清，谢珊珊，吴定昌

(福建省龙岩市第一医院，福建医科大学附属龙岩第一医院检验科，福建 龙岩 364000)

高血压作为世界最普遍的心血管疾病之一，是心力衰竭发展中最强大、可改变的危险因素，影响全球20%的人口[1-2]，在顽固性高血压人群中，血压更难以有效控制[3]。家族遗传研究表明，30%～50%的个体间血压差异由遗传因素决定[1]。β1肾上腺素能受体(ADRB1)作为重要的心血管调节因子和治疗靶点[4]，其基因多态性在高血压、心力衰竭等许多疾病中广泛研究[5-6]，但研究结果不一致。Chen LP等[7]研究显示Arg389Gly Gly/Gly是原发性高血压的独立风险因素，但Varakantham V等[8]通过研究外周血单个核细胞mRNA发现ADRB1多态性与原发性高血压的遗传风险无关。本研究通过构建ADRB1单核苷酸多态性慢病毒载体，并转染进H9C2心肌细胞，从而构建ADRB1稳定过表达的心肌细胞模型，为进一步研究ADRB1基因多态性在高血压、心力衰竭等心血管疾病发病及β受体阻滞剂药效学的机制及功能奠定了实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 PrimeSTAR酶、Taq酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒FQ,均为Takara公司。DMEM(高糖)培养基、胎牛血清(FBS)、谷氨酰胺、青霉素-链霉素、胰酶-EDTA(0.25%)、无钙镁的磷酸盐缓冲液、Hanks’平衡盐溶液，均为GIBCO BRL公司。BamHI-HF：NEB公司。质粒小抽试剂盒：Promega公司。质粒大抽试剂盒：Qiagen公司。无缝克隆试剂盒和SunBioTMTrans-EZ常见细胞系转染试剂购自上海生博生物医药科技有限公司。胰酶：Invitrogen公司。聚凝胺：Sigma公司。PMT399质粒载体购自世翱(上海)生物医药科技有限公司。慢病毒包装质粒pCMV-dR8.9和pCMV-VSV-G购自Addgene公司。H9C2细胞株、293T细胞株购自美国ATCC细胞库。

1.2 仪器 DNA电泳槽和稳压电泳仪：北京六一仪器厂；凝胶成像仪：上海天能科技有限公司；恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；恒温摇床：太仓市实验设备厂；PCR仪(Applied Biosystems)；冷冻高速离心机：Thermo Scientific公司；CO2培养箱：ESCO公司；IX71型荧光显微镜：Olympus公司；ABI PRISM 7500实时定量PCR仪。采用E.coli DH5α作为感受态细胞。

1.3 含ADRB1(1165 G>C)基因多态性的慢病毒质粒载体构建 根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)中ADRB1基因编码区序列，设计3对引物用于PCR钓取目的基因ADRB1 (1165 G>C)多态性序列(见表1)，引物送上海捷瑞生物工程有限公司进行引物合成。PCR扩增获得ADRB1基因多态性片段(见图1A)；用BamHI-HF对PMT399载体进行酶切，回收8385bp载体片段(见图1B)。将目的DNA片段和线性化载体以摩尔比2∶1加到试管中进行重组反应，混匀后在42℃孵育30 min，然后转移到冰上。放置2～3 min后取10 μl反应液体转化到E.coli DH5α感受态细胞中，取恰当量的转化菌液涂布于LB琼脂平板上(含表达载体相应的抗生素)，倒置平皿，于恒温培养箱中37 ℃培养16 h。挑取平板上长出的转化子重悬于10 μl LB培养液中，从中取1 μl做模板进行菌落PCR鉴定。接种阳性克隆，保种并分装100 μl送上海美吉生物医药科技有限公司测序。测序没有问题的，再接种抽提质粒。

表1 用于PCR钓取目的基因ADRB1(1165 G>C)序列引物

注：A. ADRB1(1165 G>C) 基因多态性PCR扩增产物。

1.4 慢病毒包装纯化及滴度测定 pCMV-dR8.9和pCMV-VSV-G为慢病毒包装质粒，所转染质粒带有绿色荧光蛋白(GFP)，有利于鉴定。选择293T细胞株作为病毒包装细胞，用含10% FBS、1%谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素的DMEM培养液培养。按照SunBioTMTrans-EZ 常见细胞系转染试剂说明书，将目的载体、pCMV-dR8.9和pCMV-VSV-G质粒转染293T细胞。48 h后收集细胞上清液，浓缩纯化病毒。采用定量聚合酶链式反应(QPCR)法测定病毒滴度。

1.5 慢病毒感染H9C2细胞株及ADRB1表达验证 H9C2细胞采用含10%FBS的DMEM培养液培养，细胞计数后铺6孔板，每孔20万个细胞；12 h后按照MOI=50使用慢病毒进行侵染；侵染后8 h换液，侵染后48 h加嘌呤霉素(puro)进行筛选，浓度为2 μg/ml；持续筛选2周，获得稳定株。采用QPCR方法验证ADRB1过表达效果。

1.6 统计学方法 应用SPSS 19.0软件进行t检验，比较ADRB1基因多态性过表达组、Blank组(未转染的细胞对照组)和Mock组(转染空病毒的对照组)间的ADRB1表达水平。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成功构建pSE4077和pSE4078质粒 阳性克隆送测序，经BLAST比对证明与人源ADRB1编码基因(NM_000684.3)序列吻合，证明表达质粒pSE4077(野生型)和pSE4078(突变型)连接成功。

2.2 慢病毒载体混合质粒转染293T效率 利用慢病毒感染293T细胞48 h后，用倒置荧光显微镜观察GFP荧光表达，图像显示ADRB1多态性过表达组细胞均产生GFP绿色荧光的阳性表达(见图2)。证明含有ADRB1的慢病毒过表达载体包装成功。pSE4077和pSE4078质粒感染293T细胞后，病毒滴度测定结果表明纯化后的载体滴度分别为1.56×109IU/ml和3.04×109IU/ml。

注：A. pSE4077感染，白光图；B. pSE4077感染，荧光图；C. pSE4078感染，白光图；D. pSE4078感染，荧光图。

2.3 ADRB1基因过表达验证 目的病毒pSE4077、pSE4078分别感染H9C2细胞后，用倒置荧光显微镜观察GFP荧光表达，图片显示ADRB1基因多态性病毒载体感染细胞均产生GFP绿色荧光的阳性表达，见图3。采用QPCR法检测结果显示，pSE4077和pSE4078组的ADRB1蛋白表达水平均较Blank组和Mock组显著提高(P<0.001)，见图4，且pSE4078组的ADRB1蛋白表达水平是pSE4077组的1.6倍(2523.43±93.74 vs 1537.60±38.42，P<0.001)。可见，ADRB1基因有显著过表达效果，ADRB1基因过表达稳定株构建成功。

注：A、B为H9C2-Blank；C、D为H9C2-PMT399；E、F为H9C2-pSE4077；G、H为H9C2-pSE4078。

3 讨论

ADRB1是G蛋白偶联受体(GPCR)超家族成员，介导了广泛的心血管生理反应，并对神经内分泌刺激有反应；同时其作为多种儿茶酚胺的受体，可调节心输出量和心率，在高血压及其相关心血管事件中具有重要的意义[9]。所有β受体阻滞剂的主要蛋白靶点都是ADRB1[10]。遗传多态性可能通过参与高血压发病机制的基因来调节药物反应，改变药物作用，因此在阐明人体对心血管疾病的易感性、临床表现的多样性以及对药物治疗的反应性上起着重要作用[11]。

注：*P<0.01。

ADRB1基因多态性Arg389Gly已被证实影响β肾上腺素能受体介导的细胞内信号传导，对β阻滞剂的反应有显著影响[12-13]。我们前期研究发现携带Arg389Gly Gly/Gly基因型的受试者对美托洛尔有更好的抗高血压反应[7]。但Johnson JA等[14]研究显示Arg389Gly Arg/Arg基因型携带者对美托洛尔的降压疗效较Gly等位基因携带者好，且窦晓涛[15]通过Meta分析得到与其一致结果。此外，Kang S等[16]通过对ADRB1与收缩性心力衰竭的研究发现：除携带ADRB1 Gly389Gly基因型的患者外，虽大多数ADRB1基因型均显著降低了收缩性心力衰竭发病风险，但未与其发病风险独立相关。但Guerra LA等[17]研究表明，ADRB1 389Arg可能会给更高β受体阻滞剂剂量的心力衰竭患者带来更大生存效益。可见，选择性β1-肾上腺素受体阻断作为一种重要的心血管治疗方法，可有效降低不良心血管后果的风险，且选择性β1受体阻滞剂在高血压合并缺血性心脏病或心力衰竭的治疗中仍有强有力的证据基础[18]。然而，药物相互作用、遗传变异和表观遗传修饰对肾上腺素能受体阐明与心血管疾病相关机制方面有很大影响。为进一步研究其影响机制，首先需要建立不同ADRB1基因多态性过表达的细胞模型。

本研究可选用细胞模型有乳鼠原代心肌细胞和心肌细胞株两种。乳鼠原代心肌细胞理论上能较好地表现心肌细胞的特点，更贴近实际，但其在实验过程中受诸多因素影响，因此导致可重复性不高。H9C2心肌细胞株是一种源于BD1X 大鼠胚胎心肌组织的亚克隆细胞系，具有同原代心肌细胞类似的电生理、信号转导方面的特点，且特征稳定，更易于传代培养。鉴于此，H9C2心肌细胞模型可操作性较高。

H9C2心肌细胞株已广泛用于各种心血管疾病的研究[19-20]。由于直接将目的基因转入细胞株，并进行点突变难度较高。本研究构建了基于H9C2心肌细胞株的ADRB1基因多态性过表达模型。该模型可用于研究不同单核苷酸多态性(SNP)的ADRB1过表达在心血管疾病中的作用。

为了构建本研究所需模型，面临选择基因载体和筛选稳转细胞株两个难题。后续的功能学实验和药理学实验需要建立稳定转染模型才能较好地满足实验要求。质粒、腺病毒等常用基因载体只能获得瞬时转染，均无法作为本研究的基因载体。本研究选择的慢病毒，是广泛采用的基因稳转载体，目的基因进入宿主细胞后经过反转录整合到宿主染色体上，得到持久表达。本研究选用QPCR方法进行稳转株的筛选可以避免抗性筛选的干扰。

综上所述，本研究成功构建了基于H9C2心肌细胞株的ADRB1基因单个核苷酸稳定过表达的细胞模型，为进一步研究ADRB1基因多态性与β受体阻滞剂的机制以及信号转导通路奠定了实验基础。