山西省3种野生黄芩属植物表型及分子水平分析

詹海仙，杜晨晖，刘晓丽，裴香萍，李 睿，张月荣，张朔生

(山西中医药大学 中药与食品工程学院，山西晋中 030619)

黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)为山西省十大晋药之一，根部具有抗氧化、抗炎、抗微生物、抗衰老、保肝等作用[1]。利用黄芩地上部分生产黄芩茶或黄金茶在中国北方地区由来已久，该药茶具有清热燥湿，泻火解毒，消炎和促消化等功效。黄芩还具有抗菌性好，不产生抗药性的特点，是中国药典收录的常用中药[2]。

近年的研究发现黄芩提取物还可在细胞水平有效抑制新冠病毒的复制[3]。随着黄芩功效的不断开发，其需求也呈现逐年上升的趋势，但是对野生药用植物的无序采挖导致野生黄芩资源破坏严重，已无法满足日益增长的市场需求。药用植物亲缘学提出亲缘关系越近的药用植物，其外观性状和化学成分越接近[4]。因此，从近缘种中挖掘适合的黄芩代用品是解决野生黄芩资源不足的方法之一[5]。粘毛黄芩(S.viscidulaBunge.)和并头黄芩(S.scordifoliaFisch.ex Schrank)是山西省北部分布的两种野生唇形科黄芩属植物。其中，粘毛黄芩又称黄花黄芩，以根部入药，味苦、性寒，主治肺热咳嗽、目赤肿痛、湿热等症，由于含有黄芩苷且药效相近在部分地区作为黄芩替代品使用[1,6]。并头黄芩又称头巾草，是以全草入药，性寒，微苦，具有清热解毒、泻热利尿的作用，可用于各种热毒病症的治疗，部分地区有作为药茶饮用的习俗[1,7]。上述3种材料在植株形态、叶形、花形等性状方面相似度较高，导致准确鉴定的难度较大。

目前黄芩属相关的研究主要聚焦于化学成分分析、黄酮等成分生物合成等药理、药效方面[8-9]。关于黄芩属植物学性状和种质资源的分析主要涉及黄芩和粘毛黄芩种子形态、3种黄芩植物花粉形态、黄芩植物根、茎、叶表皮形态、黄芩DNA条形码、黄芩生境和群落方面的研究[10-14]。以上研究尽管对3种黄芩的有效成分等研究相对比较明确，但仍无法快速准确对上述3种植物和药材进行鉴定。

表型性状分析是通过植物株高、叶片形态、花色、种子等形态上的差异进行材料分析，是众多鉴定方法中最直观、经济、实用的方法[15]。该方法在药用植物资源鉴定等研究上沿用至今，《中国植物志》《中国高等植物图鉴》和Flora of China等植物资源鉴定方面的书籍均主要以植物各部分形态特征作为分类依据。叶绿体微卫星(cpSSR)是一类基于叶绿体基因组序列开发的微卫星分子标记技术，既保留了核基因组分子标记的优点，又具有共显性高、多态性好、重复性强、操作简单和分布广泛等优点，可从分子水平对药用植物进行分析[16]。在表型分析的基础上利用叶绿体分子标记已在近缘种属药用植物材料的鉴定中得到应用。李思巧等[17]利用开发的cpSSR标记将花椒、竹叶花椒和日本花椒进行了准确的区分。董博然等[18]以叶绿体基因组序列为基础开发出的分子标记可以对长梗秦艽和全萼秦艽进行鉴定。借鉴其他药用植物鉴定的方法，本研究从植物学形态和分子水平对黄芩、粘毛黄芩和并头黄芩进行系统分析和鉴定，以期为开发和利用上述3种山西省野生黄芩资源奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)、粘毛黄芩S.viscidulaBunge.)、并头黄芩(S.scordifoliaFisch.ex Schrank)均为山西省左云县内采集的野生资源。左云县属于温带半干旱大陆性季风气候，春季干旱多风，夏季较热多雨，秋季潮湿温热，冬季寒冷少雪[19]。境内四面多山，中部为丘陵，平川少，山地和丘陵多。采样时分别从县域内北(张家场乡东红崖村，地理坐标N 40°03′35.35″，E 112°38′47.36″，海拔1 413.0 m)、西南(小京庄乡西碾头村，地理坐标N 39°53′55.75″，E 112°40′19.02″，海拔1 483.0 m)、东南(水窑乡五丰咀村，地理坐标N 39°55′26.39″，E 112°49′56.09″，海拔1 687.0 m)3个位置进行采样，3种黄芩每个居群采5株，共采集45株样品。3个采集地植株的采集日期分别为2020-07-11、2020-07-08、2020-07-10，种子收集时间为2020-08-20、2020-08-19、2020-08-21。

1.2 方 法

1.2.1 植株形态学鉴定 比对中国科学院1977版的《中国植物志》对3种材料进行形态学鉴定[1]。

1.2.2 种子形态鉴定 利用手持数码电子显微镜(国产光学优品，型号UM039)对3种黄芩种子的种皮表面特征分别进行观察。

1.2.3 叶绿体序列分析及引物开发 从NCBI下载黄芩和并头黄芩叶绿体基因组序列，利用MISA软件分别对序列进行分析，SSR位点搜索的标准为核苷酸1～6 bp，重复次数不少于10次、6次和5次，复合SSR<100 bp。

Primer 5.0软件以重复位点上、下游300 bp的序列为模板序列进行引物开发。引物的设计标准为：GC含量在30%～70%，产物大小为100～300 bp，Tm值为55 ℃～65 ℃，上下游引物Tm值差异不超过5 ℃，引物长度为15～25 bp，引物GC含量30%～70%。

1.2.4 分子鉴定 参考Dellaporta等[20]的方法，采用改良SDS法提取3种黄芩叶、根条的DNA。PCR反应体系为15 μL，反应条件为预变性95 ℃ 4 min，变性94 ℃ 1 min、复性55 ℃ 45 s、延伸72 ℃ 1 min，34个循环，延伸72 ℃ 10 min。利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR产物进行分析。

2 结果与分析

2.1 植株表型调查

植株采挖当天对株高、茎、花、叶和根的形态特征(图1～图2)等信息进行调查，待腊叶标本制作完成后对部分信息进行补充。统计发现3种黄芩主要特征比较接近，最明显的区分点为花色、根形态和颜色等特征(表1)。其中，株高方面黄芩最高，并头黄芩次之，粘毛黄芩最低。黄芩和粘毛黄芩花序顶生，并头黄芩花序单生，黄芩和并头黄芩花冠呈蓝色或蓝紫色，粘毛黄芩花冠为黄白色。根茎方面，黄芩和粘毛黄芩的根粗壮，外皮深棕色，而并头黄芩根茎纤细，外皮为白色。

表1 3种黄芩属植物形态

图1 植株表型

图2 花的表型

2.2 种子表型鉴定

肉眼观察发现3种黄芩的种子不易区分，黄芩和粘毛黄芩种子直径大小接近，黄芩种子为黑褐色，粘毛黄芩种子发白。并头黄芩直径最小，颜色接近绿棕色(图3)。利用手持数码电子显微镜则很容易区分3种黄芩的种子，黄芩和粘毛黄芩种子均呈卵球形，粘毛黄芩种子表面有明显的白色膜状物，并头黄芩种子表面则密布明显的瘤状突起(图4)。

图3 肉眼观察的种子形态

图4 显微镜下的种子形态

2.3 分子鉴定

2.3.1 黄芩和并头黄芩cpSSR重复基元分析 MISA软件搜索黄芩和并头黄芩叶绿体基因组的SSR位点，获得55个cpSSR位点(表2)。其中，黄芩叶绿体基因组中，单核苷酸重复基元A/T和C/G的cpSSR位点28个(占总位点数的 93.33%)，二核苷酸重复基元(AT/TA)的cpSSR位点有2个(占总位点数的6.67%)。并头黄芩叶绿体基因组中，单核苷酸重复基元A/T和C/G的cpSSR位点23个(占总位点数的92.00%)，二核苷酸重复基元(AT/AT)2个(占总位点数的8.00%)。

表2 不同SSR重复基序

2.3.2 引物的筛选及验证 引物信息见表3。以黄芩和并头黄芩叶绿体基因组中重复序列为基础，分别设计出78对黄芩cpSSR引物和69对并头黄芩cpSSR引物。随机选取黄芩和并头黄芩各10对引物对3种黄芩进行鉴定分析，发现有5对引物能扩增出特异性条带。来源于并头黄芩的1对引物BTHQY1能对3种材料进行准确区分，其中，BTHQY1在黄芩样品中扩增出约240 bp和500 bp大小的条带，在粘毛黄芩样品中扩增出约350 bp和750 bp大小的片带，在并头黄芩中扩增出约300 bp和800 bp大小的片段。其他4对引物只能对1种黄芩进行鉴定，BTHQY5和HQY7分别在粘毛黄芩中扩增出约200 bp和370 bp特异的条带，可将粘毛黄芩单独进行区分。来源于黄芩的引物HQY5和HQY8能在并头黄芩中扩增出约360 bp和230 bp的条带，从而可对并头黄芩进行鉴定(图5)。

表3 引物信息

M.Marker; 1.黄芩; 2.粘毛黄芩; 3.并头黄芩

3 讨 论

黄芩、粘毛黄芩和并头黄芩是山西省北部分布数量较多的3种黄芩属野生资源。研究表明，黄芩根条中含有黄芩苷和黄芩素等黄酮类成分，而黄芩地上部分中野黄芩苷、芹菜素、白杨素等成分含量相对较高[21-22]。粘毛黄芩根条中主要含有黄芩素、汉黄芩素、白杨素等多个黄酮类化学成分，粘毛黄芩和并头黄芩全草中含有白杨素等黄酮类成分[23-25]。上述3种黄芩属植物不仅具有相同或相似的化学成分，且在植株、种子和根条形态上相似度也较高，为充分利用山西省野生黄芩属资源，本研究对3种黄芩的植株表型进行分析发现其花色、根形态和颜色具有一定的区分度。但三者种子颜色和形态比较接近，肉眼很难进行准确区分。赵丽丽等[10]利用扫描电镜对黄芩和粘毛黄芩进行分析发现二者种皮表面超微结构差异明显，但是扫描电镜不适用于大田直接观察。而本研究利用手持数码电子显微镜明显区分出3种材料种皮颜色不同，同时还可根据种皮表面是否有瘤状突起对3种材料的种子进行快速、准确的鉴定。

与核基因组相比叶绿体基因组具有基因数量少、编码区范围小、进化速度慢、母系遗传、有效变异位点多的优点[26-27]。在叶绿体基因组基础上开发出的cpSSR标记已广泛应用于三七、薏苡、花椒、丹参、菊科植物遗传多样性、资源鉴定、亲缘关系的研究中[28-31]。本研究对黄芩和并头黄芩叶绿体基因组序列的SSR位点进行分析，发现黄芩和并头黄芩叶绿体重复基元具有碱基偏好性，均以A/T为主要重复单元，而黄芩二核苷酸重复基元为AT/TA基序，并头黄芩则为AT/AT基序。在此基础上设计开发黄芩和并头黄芩的cpSSR引物，经筛选有5对引物可对黄芩、粘毛黄芩和并头黄芩进行鉴定。同时，分子鉴定过程中分别提取3种材料的叶片和干燥根部的DNA，最终电泳结果一致，说明本研究筛选出的特异性标记，既可用于植物材料的鉴定，也可用于黄芩属药材的区分。

综上所述，本研究通过花色、根形态、根颜色和种子等表型性状可初步区分黄芩、粘毛黄芩和并头黄芩。同时，在分析黄芩和并头黄芩叶绿体基因组的基础上开发出5对可用的cpSSR标记，从而将表型和分子技术相结合对3种山西省黄芩属野生资源进行准确鉴定，结果对充分开发和利用山西省省域内黄芩属资源具有重要的意义。