基于16S rDNA扩增子测序技术分析猪乳汁中微生物菌落多样性

刘 丽，聂晓彤，黄 迪，刘兆敏，李 梦

（德州学院生物物理研究院，山东 德州 253023）

作为我国农业和国民经济的重要基础，生猪养殖一直受到广泛关注。目前针对仔猪已展开大量研究，但主要集中于断奶后仔猪营养、疾病预防等方面，对哺乳期仔猪的研究相对较少[1]。哺乳期是仔猪生长发育最快、最易患病死亡的时期[2]，对该阶段进行研究可为生猪养殖提供理论指导。

乳汁是哺乳期仔猪的主要食物，其成分对仔猪的生长发育具有重要影响。目前对乳汁的报道主要集中在乳铁蛋白、免疫蛋白和脂肪酸等生物活性物质[3]，但此外，乳汁中还含有丰富的微生物[4]。已证实，母仔之间可通过母乳途径进行微生物垂直传递[5]，这些微生物构成子代肠道微生物的先锋菌群，在一定程度上决定了子代肠道菌群的形成与发展[6]。因此，本研究以养殖场常见猪种大白猪和皮特兰猪为模型，通过高通量测序研究猪乳不同泌乳阶段乳汁微生物的变化，为进一步研究仔猪饲料中的益生菌添加提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

选择山东省新希望六和农牧公司两品种（大白、皮特兰）具有相似预产期的健康母猪各8只，于妊娠第113天的上午9:00肌内注射氯前列醇（每头母猪0.2 mg）确保同步生产。分别在第0天（分娩当天）和第7天收集每头母猪乳汁，按照大白猪初乳、大白猪成熟乳、皮特兰猪初乳、皮特兰猪成熟乳分为4组，依次编号为：YC、YM、PC、PM，置于液氮中随后储存于 -80 ℃ 冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 乳汁样本总DNA提取每个样本各取800 μl加入1.5 ml离心管中，于12 000 g离心机离心10 min，弃上清液。使用Easy Pure® Micro Genomic DNA Kit DNA提取试剂盒提取总DNA，采用1 % 琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.2 PCR反应和高通量测序委托上海美吉生 物医药科技有限公司进行后续PCR反应及上机测序。测序引物为515F：5'-GTGCCAGCMGCCGC GGTAA-3'和806R：5'-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3'，测序区域为V4区，测序平台是Illumina MiSeq。

1.2.3 生物信息学分析通过Usearch 11进行97 % OTU聚类，并生成特征表，与Silva数据库比对，得到注释结果，利用Mothur软件和Qime软件分别进行菌群α多样性和β多样性分析。

2 结果

2.1 乳汁微生物样本测序及聚类分析结果

利用16S rDNA测序技术对样本进行序列测定，获得2390391条高通量序列，长度在221 bp～260 bp之间。OTU聚类结果表明，所测数据片段可以聚类成11 165个OTU，分布于68个门（phylum）、149个纲（class）、405个目（order）、783个科（family）、1 933个属（genus）和4 329个种（species）（图1）。

图1 乳汁微生物运算分类单元维恩分析图

2.2 乳汁微生物样本多样性分析

采用t检验计算乳汁微生物丰富度指数（Chao1）和多样性指数（Shannon）。由表1可知，成熟乳微生物群落的Chao1和Shannon指数较初乳降低，说明随着时间的增加，乳汁菌群多样性和丰富度降低。PCoA主坐标分析发现，成熟乳组与初乳组样本离散程度较大，表明母猪不同泌乳阶段乳汁菌群结构差异较大。

表1 样本Alpha多样性统计

图2 各组乳汁微生物PCoA主坐标分析图

2.3 乳汁微生物组成分析

2.3.1 门水平

16S rDNA测序结果表明，母猪乳汁细菌群落在门水平上以厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门为主（表2）。与初乳相比，成熟乳中变形菌门丰度较高，而厚壁菌门和放线菌门丰度较低，拟杆菌门在大白猪乳汁中丰度较低，而在皮特兰猪乳汁中丰度较高。上述结果表明母猪乳汁菌群中优势门的种类及丰度随时间的变化而呈现不同程度的变化。

表2 乳汁成熟度对微生物群落优势门相对丰度的影响

在大白母猪不同泌乳阶段，变形菌门相对丰度随着时间变化而显著增加（P＜0.05，下同），其他菌门变化不显著；在皮特兰母猪不同泌乳阶段，厚壁菌门相对丰度随着时间极显著减少，变形菌门和拟杆菌门相对丰度随着时间极显著增加，而放线菌门相对丰度随着时间显著减少。该结果表明母猪乳汁菌群中优势门的种类及丰度随时间的变化与母猪的品种有关。

2.3.2 属水平

表3表明，在母猪乳汁中相对丰度较高的前10个属中，随着时间的增加，大白猪乳汁中，丛毛单胞菌属相对丰度极显著增加，埃希氏-志贺氏菌属相对丰度显著增加，莫拉氏菌属和拟杆菌属相对丰度显著减少，而其他菌属丰度变化不显著；皮特兰猪乳汁中，埃希氏-志贺氏菌属和丛毛单胞菌属相对丰度极显著增加，乳酸杆菌属和链球菌属相对丰度极显著减少，罗姆布茨菌属和严格梭菌属相对丰度显著减少。在两品种猪乳中相对丰度随时间显著增加的优势属均具有埃希氏-志贺氏菌属和丛毛单胞菌属，而显著减少的优势属各有不同。

表3 乳汁成熟度对微生物群落优势属相对丰度的影响

3 讨论

本研究采用16S rDNA测序技术对大白猪和皮特兰猪乳汁进行测序，通过OTU聚类分析、α多样性分析和β多样性分析发现，母猪初乳微生物丰富度和多样性均高于成熟乳，且不同泌乳阶段菌群结构差异较大，这可能与初乳中拥有更多的营养因子和生物活性物质有关，这些物质促进了初乳中微生物的生长发育。

通过对菌群组成进行分析，本研究发现，乳汁中细菌分属68个门，其中厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门为母猪乳汁优势菌门，这与Jiang[7]对牦牛乳的研究结果基本一致。猪品种和泌乳阶段显著影响乳汁中优势菌群相对丰度的变化。Drago[8]等通过构建微生物网络证明乳汁中的微生物群处于动态发展中，这与本研究结果一致，而不同品种母猪饮食的差异等因素可导致这种影响的发生。

大量研究表明母乳中存在潜在致病菌，其对仔猪健康产生深远影响。仔猪体内右旋天冬氨酸会增加埃希氏-志贺氏菌属丰度而诱发肠道炎症[9]。Lopez-Serrano等[10]从仔猪体内分离出具有致病性的莫拉氏菌株，该菌株可导致仔猪呼吸道疾病的发生[11]。此外，链球菌属也可致仔猪发生呼吸道疾病[12]。近年来研究发现拟杆菌可引起断奶期仔猪腹泻的发生[13]。本研究虽通过高通量测序以及查阅相关文献在母猪乳汁中发现部分致病菌，但对于其在仔猪疾病和健康中的影响还需做进一步评估。