免疫亲和柱-高效液相色谱法测定食品中 玉米赤霉烯酮的含量

王 燕，林明娥

（贵港市公共检验检测中心，广西贵港 537100）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）又称为F-2毒素，主要是由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌和雪腐镰刀菌等产生的有毒代谢产物，主要存在于易受真菌污染的玉米、小麦、高粱和大米等谷物中[1]。目前，检测玉米赤霉烯酮的方法有高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）、高效液相色谱-质谱联 用 法（High Perfomance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS）、气相色谱法（Gas Chromatography，GC）、荧光光度法（Fluorescence Spectrophotometry，FS）、薄层层析法（Thin Layer Chromatography，TLC）和免疫学检测法等。其中，免疫学检测方法方便、实用，但可能会出现假阳性，适合于大规模样品的快速检测[2]；高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法具有准确度高、灵敏性强、可微量测定等优点。《食品安全国家标准 食品中玉米赤霉烯酮的测定》（GB 5009.209—2016）第一法液相色谱法，该法通过免疫亲和柱净化后用荧光检测器检测，适用于粮食和粮食制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品、大豆、油菜籽和食用植物油中玉米赤霉烯酮的测定，样品适用范围广，灵敏度高[3]。

1 材料与方法

1.1 样品

样品为2021年贵港市食品监督抽检样品及委托检验样品。样品共7份，种类包括面条、面包、玉米粉、面粉、酱油、花生油和葡萄酒等。

1.2 仪器与试剂

1260B高效液相色谱仪配荧光检测器（美国安捷伦公司）；Simplicity纯水系统（Millipore公司）；Quintix2102-1CN电子天平[赛多利斯仪器（北京）系统有限公司]；可调移液器（芬兰百得公司）；Proline Prospenser瓶口分液器（芬兰百得公司）；自动涡旋仪（逗点生物有限公司）；超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；高速离心机（Sigma Laborzentrifugen GmgH）；固相萃取仪（上海乔跃电子有限公司）；玉米赤霉烯酮免疫亲和柱（青岛普瑞邦生物工程有限公司）。

玉米赤霉烯酮标准溶液（Pribolab Pte.Ltd.Singapore.）；甲醇、乙腈（色谱纯，上海安谱）；试验用水均为超纯水（电阻率为18.25 MΩ·cm）。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

所有样品经粉碎及混匀后，用电子天平称取 10 g（精确至0.01 g）置于50 mL聚氟乙烯具塞离心管中，加入1 g氯化钠和20.00 mL乙腈-水（9+1，V/V）提取液，拧紧瓶盖，于自动涡旋仪涡旋5 min，超声30 min，6 000 r/min离心5 min，取上清液1.00 mL加入4.00 mL水涡旋混合，6 000 r/min离心5 min，取上清液2.50 mL自然重力缓慢过免疫亲和柱，用40 mL超纯水分次淋洗，弃去全部流出液后，抽取真空至无液体流出，用5 mL甲醇分次进行洗脱，50 ℃下氮气吹干，用1.00 mL乙腈-甲醇-水（46∶46∶8，V/V/V）复溶，待漩涡混合均匀后，过0.45 μm有机相微孔过滤膜，上机分析。

1.3.2 仪器条件

色 谱 柱：Eclipse plus C18（100 mm×4.6 mm， 3.5 μm）；柱箱温度：30.0 ℃；柱流量：0.80 mL/min；进样体积：20.00 μL；检测器：荧光检测器，激发波长λ=274 nm，发射波长λ=440 nm；流动相：乙腈-甲醇-水（46∶46∶8，V/V/V）等度洗脱。保留时间定性，外标法定量。

1.3.3 标准曲线和精密度试验

准确吸取浓度为100.1 μg/mL的玉米赤霉烯酮标准溶液1.00 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈-甲醇-水（46∶46∶8，V/V/V）流动相定容至100 mL，摇匀，即得1.001 μg/mL的玉米赤霉烯酮标准储备液。用流动相稀释配制5.00 ng/mL、10.00 ng/mL、15.00 ng/mL、20.00 ng/mL、30.00 ng/mL和50.00 ng/mL的标准使用系列溶液，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。计算结果时需扣除空白值，检测结果以2次测定值的算术平均值表示。所有样品按双平行测定，以重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%，考查检测方法的精密度。试样中玉米赤霉烯酮含量的计算公式如下：

式中：X为试样中玉米赤霉烯酮的含量，μg/kg；m为试样的质量，g；ρ为试样测定液中玉米赤霉烯酮的浓度，ng/mL；V1为试样提取液体积，mL；V2为过柱净化试样提取液体积，mL；V3为测定液最终定容体积，mL；1 000为单位换算常数。

1.3.4 添加回收率试验和检出限

加标样品处理方法为在样品中分别加入1.00 mL和2.00 mL的1.001 μg/mL的标准储备液，两个浓度水平进行水平行加标，按照样品处理方法制备。分别做平行测定，考查测定方法的准确性。以3倍信噪比，考虑称样量及体积计算实际检出限。检出限计算公式如下：

式中：LOD为检出限，μg/kg；ρ为标准溶液浓度，ng/mL；m为试样的质量，g；f为稀释倍数；S/N为仪器测定的信噪比。

2 结果与分析

2.1 条件优化

本试验采用免疫亲和前处理技术提取食品中的玉米赤霉烯酮，与《食品安全国家标准 食品中玉米赤霉烯酮的测定》（GB 5009.209—2016）检测方法相比，本方法检测粮食样品质量由40 g降低为10 g，提取容器采用的是50 mL具塞离心管，便于离心分离，采用离心方式进行固液分离，而非滤纸过滤分离也缩短了分离时间，提高了检测效率，适合大批量样品同时进行提取。

2.2 标准曲线及线性关系

试验结果显示，该方法检测玉米赤霉烯酮保留时间在5.809 min，在5.00～50.00 ng/mL具有良好的线性关系，y=0.021 33x+0.002 95，标准曲线的相关系数为0.999 91，具体见图1、图2。

图1 标准曲线及线性关系结果

图2 标准品的色谱图

2.3 检出限

该方法的实际检出限为3.89 μg/kg。标准方法中对粮食和粮食制品中玉米赤霉烯酮的检出限为 5 μg/kg，定量限为17 μg/kg；酒类中玉米赤霉烯酮的检出限为20 μg/kg，定量限为66 μg/kg；酱油、醋、酱及酱制品中玉米赤霉烯酮的检出限为50 μg/kg，定量限为165 μg/kg；大豆、油菜籽、食用植物油中玉米赤霉烯酮的检出限为10 μg/kg，定量限33 μg/kg。该方法的检出限均小于标准方法中的检出限。

2.4 样品检测结果

本次抽检的7份样品中，按低于检出限为未检出，样品均未检出玉米赤霉烯酮。

2.5 加标回收率及精密度

在样品中按100.1 ng/kg及200.2 ng/kg的水平加入玉米赤霉烯酮标准溶液，计算该方法的回收率，均进行平行测定。结果显示，该方法的样品回收率为83.9%～95.9%，相对标准偏差为0.2%～8.7%，表明该方法准确度高，精密度好。结果见表1。

表1 样品检测结果及加标回收试验结果

3 结论

本研究优化了各类食品中玉米赤霉烯酮的免疫亲和-高效液相色谱检测方法。该方法标准曲线线性良好，浓度范围宽，灵敏度高，样品适用范围广，具有较高的精密度和准确度，检出限较低，检测效率高，能同时处理大批量样品，对大部分检测实验室均适用。随着检测技术的不断提升，气相色谱质谱联用、液相色谱质谱联用技术可实现多种毒素的同时检测，检测的灵敏度、结果稳定性、重现性进一步提高，但检测仪器价格昂贵。因此，应根据实际需求选择合理的检测方法[4-5]。