低聚半乳糖原料聚合度的检测和研究

陈文庭，俞 淑，林毅侃

（上海市质量监督检验技术研究院，上海 200233）

低聚半乳糖（Galacto-Oligosaccharides，GOS）是一种功能性的低聚糖，1～7个半乳糖基半乳糖或葡萄糖通过糖苷键链接。在自然界中，动物的乳汁中存在微量的低聚半乳糖，而母乳中低聚半乳糖含量较多[1]。低聚半乳糖具有调节肠道菌群[2]、改善肠道功能[3]、提高人体免疫力[4]等功能。由于低聚半乳糖是一个多聚合度的混合物，没有相应的标准品可进行定性和定量，导致目前国内检测行业中低聚半乳糖检测的技术方案成熟度较低，难以有新的技术突破，也没有相关的检测标准。国际方面针对低聚半乳糖已发布了《离子色谱法检测食品中的低聚半乳糖》（AOAC.2001.02）[5-8]。该方法采用β-半乳糖苷酶将食品中的低聚半乳糖酶解为半乳糖，使用离子色谱法测定食品中的半乳糖含量，减去已知含量的乳糖酶解后产生的半乳糖，得出低聚半乳糖酶解所产生的半乳糖的量，并通过半乳糖含量和低聚半乳糖平均聚合度计算出折算因子k值，得出产品中低聚半乳糖的含量。由于AOAC.2001.02并未明确规定折算因子k值，因此聚合度折算因子k值的确定是该方法的难点，严重影响数据的准确性。本研究拟从低聚半乳糖原料入手，使用高效液相色谱示差折光检测器法和离子色谱法两种方法对低聚半乳糖各个组分进行分离、定量，计算出10个原料产品的低聚半乳糖平均聚合度，为折算因子k值的确定提供参考依据，提高食品中低聚半乳糖检测的准 确性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂

氢氧化钠（色谱纯）；乙酸钠（色谱纯）；亚铁氰化钾（分析纯）；乙酸锌（分析纯）；麦芽五糖标准 品；麦芽四糖标准品；麦芽三糖标准品；乳糖标准品；1,3(4)-β-D-半乳二糖标准品；异乳糖标准品。

1.1.2 仪器与设备

Agilent-1260高效液相色谱仪（配四元泵、柱温箱、馏分收集器、示差折光检测器，美国Agilent公司）；ICS-6000离子色谱仪（配四元梯度泵、脉冲安培检测器，美国Thermo公司）；5910R高速离心机（德国Eppendorf公司）。

1.1.3 溶液配制

①亚铁氰化钾溶液。称取15.00 g亚铁氰化钾，用水溶解并定容至100.0 mL，室温保存，可使用3个月。②乙酸锌溶液。称取30.00 g乙酸锌，用水溶解并定容至100.0 mL，室温保存，可使用3个月。参考《食品安全国家标准 食品中牛磺酸的测定》（GB 5009.169—2016）对乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液保质期的规定，即在室温下3个月内稳定。 ③0.5 mol/L氢氧化钠溶液。量取26.1 mL 50%的氢氧化钠溶液，超纯水定容至1 L，超声混匀，现配现用。④0.5 mol/L乙酸钠溶液。称取41.02 g的乙酸钠，超纯水溶解后定容至1 L，超声混匀，现配现用。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

准确称取0.1 g麦芽五糖标准品、0.1 g麦芽四糖标准品、0.1 g麦芽三糖标准品和0.1 g乳糖标准品分别溶于100 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度。吸取各标准溶液1 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，配制成麦芽五糖、麦芽四糖、麦芽三糖和乳糖混合标准工作液（100 mg/L）供液相色谱法测试。

准确称取0.1 g 1,3(4)-β-D-半乳二糖标准品、 0.1 g乳糖标准品、0.1 g异乳糖标准品分别溶于100 mL 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度。吸取各标准溶液1 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，配制成1,3(4)-β-D-半乳二糖、乳糖、异乳糖标准工作液（100 mg/L）供离子色谱法测试。

1.2.2 样品前处理

称取5.00 g（精确到0.000 1 g）低聚半乳糖原料于50.0 mL刻度具塞管或离心管中，加入约40.0 mL水振荡摇匀。加入4.0 mL乙酸锌溶液和4.0 mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，静置10 min，沉淀蛋白质。用水定容至50.0 mL，6 000 r/min离心5 min，上清液用 0.22 μm滤膜过滤，供高效液相色谱和离子色谱。

1.2.3 仪器条件

（1）高效液相色谱条件。色谱柱：Agilent Ag+色谱柱（200 mm×10 mm）；流动相：100%水；柱温：80 ℃；流速：0.3 mL/min；进样量：100 μL。色谱柱升温时使用0.1 mL/min水淋洗，待柱温升至80 ℃后，将流速设置为0.3 mL/min。

（2）离子色谱条件。Dionex CarboPac PA1色谱柱（250 mm×4 mm）；Dionex CarboPac PA1保 护 柱 （50 mm×4 mm）；流速为1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量25 μL。检测器：脉冲安培检测器，金工作电极，Ag/AgCl参比电极，糖四电位波形。淋洗液A为超纯水，B为0.5 mol/L氢氧化钠溶液，C为0.5 mol/L乙酸钠溶液，使用前通氮气30 min，梯度洗脱见表1。

表1 梯度洗脱条件

1.2.4 保留时间确定实验

将配制好的麦芽五糖、麦芽四糖、麦芽三糖混合标准工作液注入超高效液相色谱仪，记录其出峰时间，分别用于定性低聚半乳糖DP=5，低聚半乳糖DP=4，低聚半乳糖DP=3。将配制的1,3(4)-β-D-半乳二糖、乳糖、异乳糖混合标准工作液（100 mg/L）注入离子色谱仪，记录其出峰时间。

1.2.5 计算方法

聚合度2（含乳糖）、3、4、5、6（含6以上）低聚半乳糖分别占总糖比例的计算公式如下：

式中：Wi为试样中不同聚合度的低聚半乳糖（2、3、4、5、≥6）占总低聚半乳糖的质量分数，%；Ai为试样中待测低聚半乳糖聚合度的峰面积，mAU·s；ADP2为试样中低聚半乳二糖的峰（含乳糖）面积，mAU·s；ADP3为试样中低聚半乳三糖的峰面积，mAU·s；ADP4为试样中低聚半乳四糖的峰面积，mAU·s；ADP5为试样中低聚半乳五糖的峰面积，mAU·s；ADP≥6为试样中低聚半乳六糖（含聚合度6以上）的峰面积，mAU·s。

1,3(4)-β-D-半乳二糖或异乳糖占总二糖比例的计算公式如下：

式中：Wi为试样中1,3(4)-β-D-半乳二糖或异乳糖占二糖的质量分数，%；Ai为试样中1,3(4)-β-D-半乳二糖或异乳糖的峰面积，nC·min；A1为试样中1,3(4)-β-D-半乳二糖的峰面积，nC·min；A2为试样中乳糖的峰面积，nC·min；A3为试样中异乳糖的峰面积，nC·min。

1,3(4)-β-D-半乳二糖或异乳糖占总二糖比例的计算公式如下：

式中：r2为聚合度为2的低聚半乳糖在总糖中的百分比含量，%；w1为由式（2）得出的1,3(4)-β-D-半乳二糖占二糖的质量分数，%；w2为由式（2）得出的异乳糖占二糖质量分数，%；w3为由式（1）得出的低聚半乳糖二糖（含乳糖）占总低聚半乳糖质量分数，%。

2 结果与分析

2.1 检测方法的选择

市面上大部分的低聚半乳糖原料产品主要是乳糖及不同聚合度的低聚半乳糖的混合物，由于组分结构相似，不易进行分离和纯化。现有的检测方法包括毛细管电泳法、气相色谱法、分光光度法、高效液相色谱法和离子色谱法等[9]。毛细管电泳法对分离带电荷的糖类具有独特的优势，但该仪器检测灵敏度较低，市场普及性不高，应用前景不佳[10]。气相色谱法检测糖类物质需先将目标物质衍生转化为易挥发物质后进行检测，操作步骤烦琐，易造成实验误差。

本文采用液相色谱配置示差检测器，可有效分离低聚半乳糖原料中不同聚合度的糖类，操作简单、灵敏度较高、重现性好[11]。考虑到原料产品中，可能夹杂着聚合度同样为2的乳糖，对低聚半乳二糖的数据造成干扰，本方法采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法单独检测低聚半乳二糖。由于糖类化合物有弱酸性及亲水性的特性，可在较强的碱性溶液中以阴离子形态存在，可使用强碱性溶液作为流动相进行阴离子交换分离，有效分离不同种类的低聚半乳二糖与乳糖[12-13]。

2.2 高效液相色谱条件的优化

为有效分离不同聚合度的低聚半乳糖，本文使用液相色谱配置示差检测器并连接Ca2+和Ag+两种色谱柱。根据配体交换原理分析糖类物质，即糖分子端基异构碳上所带羟基可被去质子化后带上强的负电荷，这些负电荷与Ag+柱或Ca2+柱填料的树脂表面金属离子所带的正电荷之间相互作用可使糖分子被保留，低聚糖在洗脱时根据保留性质的强弱和分子量的大小达到分离[8,14]。两种色谱柱在流动相为纯水，柱温80 ℃的条件下，出峰顺序依次是六糖（含聚合度6以上的糖）、五糖、四糖、三糖、二糖、葡萄糖、半乳糖。在相同的色谱条件下，Ag+柱的三糖和二糖的分离度比Ca2+更高。因此，选择Ag+色谱柱作为液相色谱柱。Ag+色谱柱分离色谱图见图1。

图1 Ag+色谱柱分离色谱图

2.3 离子色谱条件的优化

高效阴离子交换色谱分析糖类化合物时，所用的淋洗液主要是氢氧化钠或氢氧化钠和乙酸钠的混合液[15]。淋洗液中的OH-作为置换离子，提供强碱性环境，使弱酸性的糖以阴离子形态存在，还能起到淋洗离子作用，洗脱并分离糖[15-16]。为获得较高的灵敏度，要求流动相维持高pH：当pH增加时，糖的解离度增加，在色谱柱上的保留能力增强。此外，淋洗能力的增强，也增加了置换离子（OH-）的浓度，使糖的保留时间缩短[12-15]。在pH高到足以使碳水化合物定量离解前，其与置换离子的作用相互抵消。如果pH继续增加，糖的保留时间将缩短，该pH值取决于糖的pKa值[15-19]。

以往的淋洗方式主要采用单淋洗分离，但单组分淋洗液淋洗方式的分析时间较长，且对保留时间长的组分灵敏度不高。考虑到离子色谱仅有保留时间一种定性方式，而PA1色谱柱在柱效不稳定时，保留时间会有明显的变化。因此，本方法流动相条件设置为梯度洗脱，在目标峰流出后增大流动相中碱液的比例彻底清洗色谱柱，以达到稳定保留时间的目的。在方法仪器条件下的标准物质及样品色谱图见图2和图3。

图2 异乳糖、1,3(4)-β-D-半乳二糖离子色谱图和乳糖色谱图

图3 样品中二糖部分离子色谱图

2.4 平均聚合度结果计算

该研究先运用液相色谱配Ag+分析柱将低聚半乳糖原料中的二糖（含乳糖）、三糖、四糖、五糖和六糖（含聚合度6以上的糖）分离，面积归一法计算各组分所占百分比。其中二糖部分除了属于低聚半乳二糖的异乳糖、1,3(4)-β-D-半乳二糖，还包含一定含量的乳糖，会影响到低聚半乳二糖比例的准确计算。因此，为区分低聚半乳二糖及乳糖，本研究采用离子色谱法配PA1色谱柱进行二糖的分离，并用面积归一化法得到低聚半乳二糖（异乳糖和1,3(4)-β-D-半乳二糖）占二糖（含乳糖）的比例。结合液相色谱法得到的二糖（含乳糖）占总低聚半乳糖的数值，计算低聚半乳二糖占总低聚半乳糖的精确比值。最后根据AOAC.2001.02方法中提供的折算因子k的计算公式，从低聚半乳糖的平均聚合度中推算出折算因子k值。使用优化后的方法检测了国内外主流的6个低聚半乳糖原料供应商的10个原料产品后，结果见表2。

表2 不同公司生产的低聚半乳糖原料的组成和占总糖比例

3 结论

本文采用液相色谱配示差检测器分离了低聚半乳糖DP2～DP≥6的糖类成分，采用面积归一化法确定含量。针对二糖中含有一定量乳糖的现象，利用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法将二糖中的乳糖和低聚半乳糖二糖进行了区分定量。通过10种不同低聚半乳糖原料的测定，确定低聚半乳糖的平均聚合度为3.3，为《离子色谱法检测食品中的低聚半乳糖》（AOAC.2001.02）中折算因子k值的计算提供了参考。