承德市售常见果蔬中叶黄素含量的测定

赵笑菲，陈 震，孙艳文*

(1．河北石油职业技术大学 化学工程系，河北 承德 067000；2．河北民族师范学院 化学与化工学院，河北 承德 067000)

叶黄素，又名“植物黄体素”，是一种广泛存在于蔬菜、花卉、水果与某些藻类生物中的天然色素[1]，叶黄素具有很好的抗氧化性，因此对于预防人体衰老、老年性黄斑区病变、白内障等疾病具有良好的功效, 叶黄素已经广泛应用于医药、保健品、食品、化妆品、饲料等领域[2]。随着人们生活节奏加快，手机电脑等电子产品不断更新普及，人们用眼时间和强度不断加大，眼疲劳增加，老年白内障等眼部疾病发病率不断升高。虽然可以通过营养品和保健品来补充叶黄素，但是过量摄入叶黄素会对肝脏造成负担，因此，建立一种简单、高效的常见果蔬中叶黄素含量的测定方法，了解不同果蔬中叶黄素的含量对人们健康膳食具有重要意义。

叶黄素具有热不稳定性，低温避光保存蔬菜水果能够有效防止其所含叶黄素发生异构化或者降解[3]。本文采用超声波辅助有机溶剂提取常见果蔬中的叶黄素，对萃取剂的种类，萃取温度，萃取时间，碱度等实验条件进行了优化，得到了最佳实验条件，在最佳实验条件下建立了一种简便，高效，可信度高的紫外可见分光光度法对叶黄素含量进行测定的方法，并对承德市售常见果蔬中叶黄素的含量进行了测定。

1 仪器与试剂

1.1 试剂

叶黄素标准品(纯度89%)购自斯坦福分析化学公司；无水乙醇(分析纯)，甲醇(分析纯)，乙酸乙酯(分析纯)，环己烷(分析纯)，二氯甲烷(分析纯)，石油醚(分析纯)，四氢呋喃(分析纯)购自天津市科密欧化学试剂有限公司；氢氧化钠购自天津市大茂化学试剂厂。

1.2 仪器

紫外可见分光光度计(T6)，北京普析通用仪器有限责任公司；超声波清洗器(KQ-100E)，昆山市超声仪器有限公司；离心机(800)，江苏省金壇市荣华仪器制造有限公司；粉碎机(BJ-150)，永康市铂欧五金制品有限公司。

2 实验步骤

2.1 溶液的配制

2.1.1 叶黄素标准储备液的配制

准确称取0.010 0 g叶黄素标准品(89%)于烧杯中，用无水乙醇溶解后定量转移至100 mL的容量瓶，定容，摇匀，配制成浓度为100 μg/mL叶黄素标准储备液，冷藏避光保存。

2.1.2 不同浓度的NaOH无水乙醇溶液的配制

分别称取0.5 g，1.0 g，2.0 g，3.0 g，4.0 g，5.0 g NaOH于小烧杯中，用无水乙醇溶解，制成浓度为5%，10%，20%，30%，40%，50%的NaOH无水乙醇溶液备用。

2.2 样品预处理

用自来水将苹果洗净，用蒸馏水冲洗，避光晾干，苹果去核切片，香蕉去皮切片，菠菜和甘蓝去除坏叶，在电子天平上称量20.000 0 g；烘箱温度设定为60 ℃，准确称取烘干后苹果片、香蕉片、菠菜和甘蓝的质量；将烘干的苹果片、香蕉片、菠菜和甘蓝用粉碎机粉碎，研磨，过60目筛[4]。

2.3 标准曲线的绘制

用移液枪分别移取50 μL，100 μL，150 μL，200 μL，250 μL叶黄素标准储备液于样品瓶中，分别加入无水乙醇2 450 μL、2 400 μL、2 350 μL、2 300 μL、2 250 μL，摇匀，配制成终浓度为2 μg/mL，4 μg/mL，6 μg/mL，8 μg/mL，10 μg/mL叶黄素标准溶液。

以4 μg/mL叶黄素标准溶液为待测样品，以无水乙醇为空白样品，用紫外可见分光光度计在440～490 nm波长范围，每间隔1 nm测定其吸光度，绘制叶黄素的吸收曲线，并确定其最大吸收波长。

在最大吸收波长下，以无水乙醇作为空白样品，分别测定0 μg/mL，2 μg/mL，4 μg/mL，6 μg/mL，8 μg/mL，10 μg/mL叶黄素标准溶液的吸光度，以叶黄素的浓度c为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制叶黄素的标准吸收曲线。

2.4 超声波辅助有机溶剂萃取条件的优化

2.4.1 萃取剂的优化

称取7份0.020 0 g菠菜粉末分别放入50 mL烧杯中，依次加入四氢呋喃，石油醚，无水乙醇，甲醇，环己烷，乙酸乙酯，二氯甲烷各24 mL，1 mL 30%的NaOH无水乙醇溶液，在超声波功率100 W，温度30 ℃条件下避光超声30 min后，混合液离心3 min，取上清液，在紫外可见分光光度计上，在最大吸收波长下测定其吸光度。

2.4.2 萃取温度的优化

称取5份0.020 0 g菠菜粉末分别放入50 mL烧杯中，各加入24 mL无水乙醇，1 mL 30%的NaOH无水乙醇溶液，依次在10 ℃，20 ℃，30 ℃，40 ℃，50 ℃，超声波功率100 W的条件下，避光超声30 min。混合液离心3 min，取上清液，在紫外可见分光光度计上，在最大吸收波长下测定其吸光度。

2.4.3 萃取时间的优化

准确称取6份0.020 0 g菠菜粉末分别放入50 mL烧杯中，加入24 mL无水乙醇，1 mL 30%的NaOH无水乙醇溶液，在超声波功率100 W，温度30 ℃下，避光超声时间分别为10 min，20 min，30 min，40 min，50 min，60 min，混合液离心3 min，取上清液，在紫外可见分光光度计上，在最大吸收波长下测定其吸光度。

2.4.4 碱度的优化

准确称取6份0.020 0 g菠菜粉末分别放入50 mL烧杯中，各加入24 mL无水乙醇，依次加入5%，10%，20%，30%，40%，50% NaOH无水乙醇溶液各1 mL，在30 ℃下，超声波功率100 W下，避光超声30 min。混合液离心3 min，取上清液，在紫外可见分光光度计上，在最大吸收波长下测定其吸光度。

2.5 承德市售常见果蔬中叶黄素含量的测定

2.5.1 样品中叶黄素含量的测定

分别称取苹果粉末1.000 0 g，香蕉粉末1.000 0 g，菠菜粉末0.020 0 g，甘蓝粉末0.100 0 g于5个50 mL烧杯中，各加入24 mL无水乙醇， 1 mL 30%的NaOH无水乙醇溶液，在超声波功率100 W，温度30 ℃下，避光超声50 min，混合液离心3 min，取上清液，在紫外可见分光光度计上，在最大吸收波长下测定其吸光度。

3 结果与讨论

3.1 叶黄素的标准曲线的绘制

根据不同波长下叶黄素的吸光度绘制其吸收曲线(图1)，发现在452 nm和482 nm处出现峰值。其中波长为452 nm处溶液吸光度为0.451，波长为482 nm处溶液吸光度为0.403，因此，确定叶黄素的最大吸收波长为452 nm。根据叶黄素的系列标准溶液在452 nm波长下的吸光度绘制叶黄素的标准曲线(图2)。叶黄素系列标准溶液在0～10 μg/mL范围内线性回归方程为Y=0.111 31X+0.001 1，相关系数R=0.999 87，线性关系良好，准确度较高，可以用于叶黄素的定量分析。

3.2 溶剂种类对萃取液中叶黄素含量的影响

叶黄素作为一种脂溶性色素，不溶于水，溶于有机溶剂[3]。通过对不同溶剂作为萃取剂时萃取液中叶黄素的含量进行测定，发现萃取液中叶黄素的含量大小顺序为甲醇>四氢呋喃>无水乙醇>石油醚>二氯甲烷>环己烷>乙酸乙酯，甲醇的萃取效果最好。其中，甲醇，四氢呋喃，无水乙醇，石油醚，二氯甲烷作为萃取剂时萃取效率相差不大，考虑到绿色环保及节约实验成本，选择无水乙醇作为萃取剂。

3.3 萃取温度对萃取液中叶黄素含量的影响

通过对不同萃取温度下萃取液中叶黄素的含量进行测定，发现随着萃取温度的升高，萃取液中叶黄素的含量逐渐增大，当萃取温度为30 ℃时，萃取液中叶黄素的含量最大。萃取温度继续升高，叶黄素的含量反而逐渐减小(图4)。这是可能由于当萃取温度低于30 ℃时，随着萃取温度越高，叶黄素越容易溶解到萃取剂中，当温度为30 ℃时，叶黄素在萃取剂中的溶解达到饱和，萃取温度继续升高，会使部分叶黄素发生降解或者异构化，反而使叶黄素的含量降低。因此，确定30 ℃作为最佳萃取温度。

3.3 萃取时间对萃取液中叶黄素含量的影响

通过对不同萃取时间下萃取液中叶黄素的含量进行测定，发现随着萃取时间的延长，萃取液中叶黄素的含量逐渐增大，当萃取时间为50 min时，萃取液中叶黄素的含量最大。50 min以后，萃取液中叶黄素含量减小(图5)，这是可能是由与当萃取时间超过50 min以后，部分叶黄素被空气中的氧气氧化分解，使叶黄素的含量下降。因此，确定50 min作为最佳萃取时间。

3.3 NaOH浓度对萃取液中叶黄素含量的影响

叶黄素是一种广泛存在与蔬菜、水果中的天然色素，但其存在形式有差别，在绿色蔬菜、水果中存在的叶黄素以游离非酯化形式存在，在黄色或橙色水果、蔬菜中的叶黄素以叶黄素酯的形式存在，需进行皂化处理[1]。同时皂化反应可被用来去除萃取物中的脂肪和叶绿素，减少对叶黄素测定的干扰[5]。通过测定不同NaOH浓度下萃取液中叶黄素的含量，发现随着NaOH浓度的增大，萃取液中叶黄素的含量逐渐增大，当NaOH浓度为40%时，叶黄素的含量最大。当NaOH浓度继续增加时，叶黄素的含量反而减小(图6)。这说明虽然增加NaOH的浓度促进叶黄素酯解离为叶黄素单体，去除萃取物中脂肪和叶绿素对叶黄素测定的干扰，但是NaOH的浓度过高，会影响叶黄素的稳定性，反而使叶黄素的含量减少。因此，确定最佳NaOH浓度为40%。

3.4 承德市售常见果蔬中叶黄素含量的测定

以无水乙醇作为萃取剂，在30 ℃下萃取50 min作为最佳果蔬中叶黄素的萃取条件，以NaOH含量为40%，对承德市售四种常见果蔬中叶黄素含量进行了测定(见表1)。实验结果表明：新鲜果蔬中叶黄素含量的大小顺序为：菠菜>甘蓝>苹果>香蕉。

表1 承德市售常见果蔬中叶黄素的含量

3.4 实验方法的精密度

取4 μg/mL叶黄素标准溶液，在紫外可见分光光度计上，在最大吸收波长452 nm下测定其吸光度，该样本中叶黄素含量的测定重复性系数为0.079%(见表2)。

表2 实验方法精密度

3.5 实验方法的加标回收率

取5.0 mL果蔬萃取上清液(苹果、香蕉、菠菜、甘蓝)至比色管中，分别加入1.0 mL浓度为4 μg/mL叶黄素标准溶液，加无水乙醇溶液定容到10 mL。在紫外可见分光光度计上，在波长452 nm下测定其吸光度，平行三次实验，计算叶黄素的含量，并计算加样回收率(表3)。承德市售四种常见果蔬中加标回收率的相对标准偏差分别为1.61%，3.839%，4.44%，0.59%，能够满足检测实际样品的检测需要。

表3 承德市售常见果蔬样品加标回收率

4 结论

本文建立了一种紫外可见分光光度法测定承德市售常见果蔬中叶黄素含量的方法。叶黄素标准曲线方程为Y=0.001 1X+0.111 31，R2=0.999 7，叶黄素标准溶液在0～10 μg/mL浓度范围内线性关系良好。通过对超声波辅助提取承德市售常见果蔬中叶黄素的实验条件进行优化，确定最佳萃取条件为以无水乙醇作为萃取剂，萃取温度为30 ℃，萃取时间为50 min，NaOH的含量为40%。在最佳实验条件下，对承德市售常见果蔬中叶黄素的含量进行了测定，实验结果表明：承德市售常见的四种果蔬中叶黄素含量高低顺序为菠菜>甘蓝>苹果>香蕉，其中新鲜菠菜中叶黄素含量最高为0.386 mg/g。该方法加标回收率能够满足检测实际样品的检测需要，可以用于叶黄素的定量分析。