分光光度法测定奶酪中亚硝酸盐含量的不确定度评定

邬 婧

（北京市朝阳区食品药品安全监控中心，北京 100124）

很多食物中都含有亚硝酸盐，亚硝酸盐对人的身体有一定的危害，新闻中报道的由亚硝酸盐引发食物中毒的事件不在少数[1-2]。我国对亚硝酸盐的使用和安全管理有着严格要求，按照标准规定使用亚硝酸盐是安全的。国家标准规定亚硝酸钠、亚硝酸钾可作为护色剂、防腐剂在腌腊肉制品、酱卤肉制品和熏、烧、烤肉等加工中使用，并规定了最大使用量和最大残留量。以下对奶酪亚硝酸盐不确定度测定工作中分光光度法的应用及不确定性来源进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市售奶酪，随机购买。3%乙酸溶液、4 g/L对氨基苯磺酸溶液；2 g/L盐酸萘乙二胺溶液；200 μg/mL亚硝酸钠标准溶液[北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司，标准物质编号GBW(E)100156]。

1.2 仪器与设备

UV-2600紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；ME203分析天平[梅特勒-托利多（上海）有限公司]；并根据要求对仪器进行校准。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

依据《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》（GB 5009.33—2016）中的第二法分光光度法进行测定。将样品研磨成均匀的泥浆状，混合均匀。称取试样2.5 g（精确至0.001 g），将选取好的样品置于150 mL具塞锥形瓶中。加水80 mL后摇匀，超声30 min后取出放置至室温。定量转移至100 mL容量瓶中，加入3%乙酸溶液2 mL，加水稀释至刻度，混合均匀。于4 ℃放置20 min，取出放置至室温，溶液经过滤纸过滤，滤液备用。

1.3.2 亚硝酸盐含量的测定

吸取40 mL滤液于50 mL带塞比色管中，另吸取亚硝酸钠标准使用液（5.0 μg/mL）0 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL和2.50 mL。然后对样品进行处理，在试管中加入2 mL的4 g/L对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5 min后加入1 mL的2 g/L盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度线，混匀后静置15 min。用1 cm比色杯，以零管调节零点，于波长538 nm处测定，绘制标准曲线，同时做空白对照[4]。

1.3.3 数学模型

式中：x为样品中亚硝酸盐含量，mg/kg；V1为样本溶液的总体积，mL；V2为样本测试液(原液)的体积，mL；m1为试样质量，g；m2为测定用样液中亚硝酸钠的质量，μg。

1.3.4 不确定度来源分析

不确定度来源包括测定样品中亚硝酸盐平均值引入的相对标准不确定度[3]、称量引入的相对标准不确定度、试样液总体积引入的相对标准不确定度、测定用样液体积引入的相对标准不确定度、亚硝酸钠标准溶液浓度引入的相对标准不确定度、紫外可见分光光度计引入的相对标准不确定度、测定用样液中亚硝酸钠的质量引入的相对标准不确定度。

2 不确定度的评定

2.1 测定样品中亚硝酸盐平均值引入的相对标准不确定度

本实验对奶酪中亚硝酸盐含量进行6次测定，测量值分别为1.298 mg/kg、1.323 mg/kg、1.302 mg/kg、1.319 mg/kg、1.322 mg/kg及1.302 mg/kg，平均值为1.311 mg/kg，计算标准偏差为0.011 5，则测定平均值引入的标准不确定度为：

平均值的相对标准不确定度为：

2.2 称量产生的相对标准不确定度

称量样品的平均质量为2.502 g，根据天平的检定证书可知，称量质量在0～50 g时，U=1.0 mg，k=2，则称量产生引入的标准不确定度为：

称量产生的相对标准不确定度为：

2.3 试样液总体积引入的相对标准不确定度

（1）对样品的定容引入不确定度进行计算，根据100 mL容量瓶的检定证书可以得出，容量瓶在进行扩展的时候扩展的不确定度是U=0.020 mL，k=2。得出样品的定容引入的标准不确定度为：

（2）温度引入的不确定度。将实验的温度控制在20 ℃，在（20±5）℃的环境进行条件反应的时候，水的体积的膨胀系数为2.1×10-4/℃。则由温度引入的不确定计算为：

（3）合成上述两项不确定度分量，试样液总体积的标准不确定度为：

试样液总体积引入的相对标准不确定度为：

2.4 测定用样液体积引入的相对标准不确定度

（1）移液过程引入的不确定度，选择样品液的剂量为40 mL，用5 mL的移液器，分8次进行提取。在选择容器的时候，容器的扩展度U=0.1%，k=2，则吸取样液体积引入的标准不确定度计算为：

（2）温度引入的不确定度。将实验的温度控制在20 ℃，在（20±5）℃的环境进行条件反应的时候，应该仔细观察水的体积的膨胀情况，此时水的体积的膨胀系数为2.1×10-4/℃。则由温度引入的不确定计算为：

（3）合成上述两项不确定度分量，测定用样液体积的标准不确定度为：

测定用样液体积引入的相对标准不确定度为：

2.5 亚硝酸钠标准溶液浓度引入的相对标准不确定度

2.5.1 亚硝酸钠标准溶液引入的不确定度

亚硝酸钠标准溶液浓度为200 μg/mL，标准溶液证书提供的不确定度U=2%，k=2，标准溶液的不确定度为：

亚硝酸钠标准溶液的相对标准不确定度为：

2.5.2 移液体积引入的不确定度

（1）用5 mL的移液器。在选择容器的时候，容器的扩展度U=0.1%，k=2，则吸取样液体积引入的标准不确定度计算为：

（2）温度引入的不确定度。将实验的温度控制在20 ℃，在（20±5）℃的环境进行条件反应的时候，应该仔细观察水的体积的膨胀情况，此时水的体积的膨胀系数为2.1×10-4/℃。则由温度引入的不确定计算为：

合成上述两项不确定度分量，移液体积的标准不确定度为：

移液体积引入的相对标准不确定度：

2.5.3 定容体积引入的不确定度

（1）100 mL容量瓶引入的不确定度。从100 mL容量瓶的检定证书中可以得出，容量瓶在进行扩展的时候扩展的不确定度是U=0.020 mL，k=2。这一过程中样品的定容是100 mL，引入的标准不确定度计算为：

（2）温度引入的不确定度。将实验的温度控制在20 ℃，在（20±5）℃的环境进行条件反应的时候，此时水的体积的膨胀系数为2.1×10-4/℃。则由温度引入的不确定计算为：

合成上述两项不确定度分量，定容体积的标准不确定度为：

定容体积引入的相对标准不确定度：

合成上述3项相对不确定度分量，亚硝酸钠标准溶液浓度引入的相对标准不确定度为：

2.6 紫外可见分光光度计引入的相对标准不确定度

紫外可见分光光度计所产生的标准不确定度，在对这些度数进行计算的时候，也应该利用特定的公式和特定的算法用波长进行检测，于波长538 nm处测定，然后还应该对波长进行扩展，仔细观察波长测量的数据，对于波长的不确定性进行记录。然后应该仔细观察波长测量的数据和紫外线可见光度的数据，利用特定的公式对紫外线可见光的光度进行计算，进而得出紫外线的不确定度。根据UV-2600紫外分光光度计的检定证书为U=0.3 nm，k=2，计算仪器的不确定度为：

仪器的相对标准不确定度为：

2.7 亚硝酸钠标准曲线引入的相对标准不确定度

实验过程中对标准曲线进行拟定，对拟定标准曲线引入的不确定度进行计算。配制9个浓度分别为0 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL、4.0 μg/mL、5.0 μg/mL、7.5 μg/mL、10.0 μg/mL和12.5 μg/mL的亚硝酸钠标准溶液，用分光光度法测量得到相应的吸光值，得到直线方程Y=bx+a和其相关系数r，如表1所示。

表1 亚硝酸盐标准曲线结果表

本实验得到的亚硝酸盐标准曲线方程为Y=0.072 508 8x-0.015 731 0，相关系数r2=0.999 61。根据拟合工作曲线有关的不确定度公式计算为[1]：

本次实验测定的样品浓度为1.311 mg/kg，则拟合标准曲线引入的相对标准不确定度为：

3 合成标准不确定度

针对以上分析的各个不确定度分量，合成相对标准不确定度为：

取包含因子k=2，则测量结果的扩展不确定度为0.032 mg/kg[5]。该奶酪中亚硝酸盐的结果是1.311 mg/kg，因此结果可表示为（1.311±0.032）mg/kg。

4 结论

总之，在对奶酪中的亚硝酸盐含量进行实验计算和提取的时候应该利用相关的公式进行数据计算，如果包含因子是2，通过公式计算出最终奶酪中亚硝酸盐含量的扩展不确定度为0.032 μg/mL。实验人员在进行实验操作的时候，应该严格按照标准进行实验操作，同时对各类数据进行详细的归类和整理。应该切实做好实验操作，严格按照步骤进行实验。