治痤胶囊高效液相色谱指纹图谱建立及多成分含量测定*

2022-05-16刘亮镜

中国药业 2022年9期

凌骢，徐斌，刘亮镜，王权

（安徽省芜湖市中医医院，安徽芜湖 241000）

治痤胶囊为安徽省芜湖市中医医院院内特色制剂（皖药制字Z20050016），由金银花、酒黄芩、焦栀子、赤芍、牡丹皮、丹参、夏枯草等12味中药组方，具有清泄热毒、化湿通腑功效，临床用于治疗热毒血浊型湿疹［1］、痤疮的效果显著，对脂溢性皮炎、酒糟鼻及皮肤溃疡亦有良好疗效。其现行质量标准仅限定了丹酚酸B 含量，指标单一，专属性差，难以保证质量和疗效［2-4］。高效液相色谱（HPLC）指纹图谱具有整体性、特征性、可量化等特点，与中药成分的复杂性、模糊性相适应，是公认的评价中药制剂质量的可靠方法［5-7］。为进一步控制治痤胶囊质量的一致性和稳定性，本研究中建立了治痤胶囊的HPLC 指纹图谱，并测定其中具有抗菌消炎活性作用的绿原酸、黄芩苷、栀子苷、芍药苷、丹皮酚［8-13］的含量，以对该制剂的质量进行有效表征、综合评价和全面控制。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent - 1200 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），配有G1314B 型可变波长检测器；XP-205 型分析天平（精度为0.01 mg），AL - 204 型分析天平（精度为0.1 mg），均购自梅特勒- 托利多仪器有限公司；KQ -500DB 型数控超声仪（上海博讯实业有限公司，功率为200～500 W，频率为40 kHz）；UPS-11-10T 型纯水机（成都优普净化科技有限公司）。

1.2 试药

绿原酸对照品（批号为110753 - 201415，纯度为96.2%），栀子苷对照品（批号为110749-201617，纯度为98.4%），芍药苷对照品（批号为110736-201741，纯度为95.7%），黄芩苷对照品（批号为110715-201821，纯度为95.4%），丹皮酚对照品（批号为110708 -201407，纯度为99.9%），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈（分析纯，美国Tedia Company公司）；磷酸（分析纯，上海展云化工有限公司）；水为自制超纯水；治痤胶囊（安徽省芜湖市中医医院制剂室，批号分别为ZS201201，ZS201202，ZS201203，ZS210101，ZS210102，ZS210103，ZS210104，ZS210201，ZS210202，ZS210203，编号设为S1-S10）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件［14-20］

色谱柱：Waters XBridgeTM-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脱（程序见表1）；流速：1.0 mL/min；检测波长：330 nm（0～13.5 min，绿原酸），230 nm（13.5～42.0 min，栀子苷和芍药苷），278 nm（42.0～60.0 min，黄芩苷和丹皮酚）；柱温：20 ℃；进样量：10 μL。

表1 梯度洗脱程序（%）Tab.1 Gradient elution procedure（%）

2.2 溶液制备

取绿原酸、栀子苷、芍药苷、黄芩苷和丹皮酚对照品各适量，分别加甲醇制成质量浓度为249.0，319.0，626.0，225.5，201.5 μg/ mL 的对照品贮备液；精密吸取此对照品贮备液1.0，1.0，0.5，2.5，0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，即得质量浓度分别为24.900，31.900，31.300，56.375，10.075 μg/ mL 的混合对照品溶液。取样品（批号为ZS201201）1 g，精密称定，置锥形瓶中，加入75%甲醇50 mL，称定质量，超声处理（功率为350 W，频率为40 kHz）30 min，放至室温，用75%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过；取续滤液2 mL，置5 mL容量瓶中，加75%甲醇定容，摇匀，即得供试品溶液。按样品处方和制备工艺制备不含金银花、焦栀子、赤芍、酒黄芩、牡丹皮的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 指纹图谱建立

2.3.1 共有峰指认

精密吸取2.2 项下混合对照品溶液和供试品溶液各适量，按2.1 项下色谱条件进样测定，共标定16 个共有峰，根据保留时间指认出1号峰为绿原酸，2号峰为栀子苷，3 号峰为芍药苷，4 号峰为黄芩苷，5 号峰为丹皮酚。详见图1。

2.3.2 方法学考察

精密度试验：精密吸取2.2 项下供试品溶液适量，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次。以栀子苷峰为参照峰，各共有峰相对保留时间的RSD为0.12%～1.04%（n= 6），相对峰面积的RSD为0.20%～2.67%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取2.2 项下供试品溶液适量，按2.1项下色谱条件分别于0，2，4，8，12，24 h时进样测定。结果以栀子苷峰为参照峰，各共有峰相对保留时间的RSD为0.09%～0.42%（n=6），相对峰面积的RSD为0.32%～2.44%（n=6），表明供试品溶液在室温下24 h内稳定性良好。

重复性试验：取样品（批号为ZS201201）适量，精密称定，按2.2 项下方法制备供试品溶液，平行6 份，按2.1 项下色谱条件进样测定。结果以栀子苷峰为参照峰，各共有峰相对保留时间的RSD为0.17%～1.75%（n= 6），相对峰面积的RSD为0.53%～2.72%（n= 6），表明方法重复性良好。

2.3.3 相似度评价

取10 批样品（批号分别为ZS201201，ZS201202，ZS201203，ZS210101，ZS210102，ZS210103，ZS210104，ZS210201，ZS210202，ZS210203）各适量，精密称定，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，将色谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）软件，结果相似度分别为0.994，0.985，0.997，0.991，0.989，0.990，0.993，0.985，0.982，0.978。

2.4 含量测定

2.4.1 方法学考察

专属性试验：精密吸取2.2 项下3 种溶液各适量，按2.1 项下色谱条件进样测定。结果阴性对照无干扰，表明方法专属性良好。色谱图见图2。

线性关系考察：精密吸取2.2项下芍药苷和丹皮酚对照品贮备液各0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，栀子苷对照品贮备液0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL，绿原酸对照品贮备液0.3，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8 mL，黄芩苷对照品贮备液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分别置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，分别配制成系列质量浓度的对照品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定。以对照品溶液质量浓度为横坐标（X，μg/mL）、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表2。

精密度试验：精密吸取2.2项下混合对照品溶液适量，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果见表2，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2 项下供试品溶液适量，分别于0，2，4，8，12，24 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果见表2，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

表2 线性关系考察及精密度、稳定性、重复性试验结果（n=6）Tab.2 Results of the linear relation，precision，stability and repeatability tests（n=6）

重复性试验：取样品（批号为ZS201201）适量，精密称定，依法制备供试品溶液，平行6 份，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并按外标法计算含量。结果见表2，表明方法重复性良好。

加样回收试验：取样品（批号为ZS201201）0.5 g，精密称定，平行6份，置50 mL容量瓶中，依次加入绿原酸、栀子苷、芍药苷、黄芩苷、丹皮酚对照品（质量浓度分别为0.7076，0.7199，0.5237，0.7403，0.7836 mg/mL）2.0，2.5，1.8，5.0，1.0 mL，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，按外标法计算含量，并计算回收率。结果见表3。

表3 加样回收试验结果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test（n=6）

2.4.2 样品含量测定

取10 批样品，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定3次，记录峰面积，并按外标法计算含量。结果见表4。

表4 样品含量测定结果（mg/g，n=3）Tab.4 Results of content determination of five components in the samples（mg/g，n=3）

3 讨论

3.1 色谱条件选择

中药制剂各成分的最大吸收波长不同，单波长下的色谱信号弱，积分误差大，而不同基线的多波长检测数据处理烦琐［21-23］。故本研究中选用了可变波长紫外检测器，根据目标成分的最大吸收波长，选择了330 nm（绿原酸）、230 nm（芍药苷和栀子苷）和278 nm（黄芩苷和丹皮酚）。磷酸溶液体积分数考察了0.1%，0.2%，0.4%，柱温考察了20 ℃和25 ℃，综合比较5 个待测成分色谱峰的分离度和对称性，最终选择0.2%磷酸溶液流动相和20 ℃柱温。