AGTR1 过表达对肝细胞癌细胞株BEL-7404 生长的影响*

蒋会荣，黄 皓，李晓龙，张馨月，台宗光，朱全刚，鲍蕾蕾，4△

（1. 蚌埠医学院药学院，安徽 蚌埠 233030； 2. 中国人民解放军海军军医大学第三附属医院，上海 200438；3. 上海市皮肤病医院，上海 200443； 4. 中国人民解放军海军军医大学第一附属医院，上海 200433）

肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌最常见的类型，由于其血管明显异常，如动脉化和毛细血管化，导致血流异常、渗漏过多等［1-2］，认为是典型的血管生成性肿瘤［3］。LEVER 等［4］的一项针对患者服用血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）的回顾性研究发现，服用该类药物患者患癌症的风险更低，也证明了血管紧张素受体抑制剂（ARB）可降低患癌风险［5］。另外，发现肾素血管紧张素（Ang）系统中一个编码血管紧张素Ⅱ1 型受体（AT1R）的基因AGTR1 在多种肿瘤中有异质性表达，且该基因的过表达会引起多种肿瘤（如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌等）的不良预后［6-9］，但HCC 中AGTR1的表达情况及其对HCC 的影响尚不清楚。越来越多的研究表明，瞄准Ang Ⅱ/AT1R 轴可通过减少血管内皮生长因子A（VEGFA）的表达来抑制血管生成和减少血管渗透，从而抑制肿瘤细胞生长和转移［10-12］。AGTR1可能通过增加VEGFA 的表达来促进肿瘤细胞的生长，同时抑制剂洛沙坦可通过抑制肿瘤血管的生成来影响肿瘤的生长。本研究中通过基因转染技术构建了过表达AGTR1 的肝癌细胞，通过体内外实验研究AGTR1 对肿瘤生长的影响，以及AGTR1 与VEGFA 表达的关系，同时考察AGTR1抑制剂洛沙坦在体内对血管生成的作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药、细胞株与动物

仪器：ABI 7300 型实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪（美国ABI 公司）；Tannon 1600 型全自动数码凝胶图像分析系统（上海天能公司）；Thermo 240型CO2培养箱（美国Thermo 公司）；Olympus ck × 53 型倒置显微镜（日本Olympus公司）。

试药：RPMI 1640 培养基（美国Hyclone 公司，批号为SH30809.01B）；胎牛血清（法国Biowest 公司，批号为S1400）；0.25%Trypsin - EDTA（美国Gibco 公司，批号为15400054）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（日本Beyotime公司，批号为P0010）；SYBR Premix EX Taq（日本TaKaRa公司，批号为639676）；引物（上海生工生物工程有限公司，批号为B661104）；M - PER（批号为78501），T -PER（批号为78510），均购于美国Thermo 公司；AGTR1特异性一抗（美国Santa Cruz公司，批号为sc-29750）；三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH，Cell Signaling Technology公司，批号为97166）；Plasmid Maxi Kit（E.Z.N.A公司，批号为D2485）；Cell Counting Kit - 8（CCK - 8）试剂盒（日本Dojindo 公司，批号为CK04）；Transwell 小室（美国Corning 公司，批号为Scipu001412）；Puromycin（德国Sigma 公司，批号为AB3258）；Isoflurane（深圳瑞沃德公司，批号为R510-22）；洛沙坦（MedChem Express，规格为1 g，批号为20170307）。

细胞株：BEL-7404肝癌细胞株购自ATCC细胞库。

动物：6 周龄雄性BALB/ c 裸鼠（上海毕凯实验动物公司，动物生产许可证号为SCXK ＜沪＞2013 -0016），于26 ℃条件下，置动物隔离器中饲养。

1.2 方法

TCGA 数据库中获取数据：通过网址https：// cancergenome.nih.gov/登陆TCGA 数据库，检索HCC RNA芯 片 数 据 集，下 载2018年1月5日至3月5日TCGA -2V - A95S～TCGA - G3 - A25S（374 肝癌RNA - Seq）和TCGA-BC-A10Q～TCGA-G3-A3CH（50 例癌旁样本）的RNA-Seq及临床数据，检索AGTR1和VEGFA基因，并整理其表达值，同时进行相关性分析。

细胞培养与转染：BEL-7404细胞置RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素），并置含5% CO2的37 ℃培养箱中培养。取对数生长期的BEL -7404细胞，均匀接种至6孔板中培养（3×105个细胞/孔），待细胞生长至30%～50%时，将2 μg 质粒DNA 加入100 μL Opti-MEM 稀释，将4 μL jetPEITM 加入100 μL Opti - MEM 稀释，将稀释后的jetPEITM 加入质粒稀释液中，轻轻混匀，室温孵育20～30 min。然后将200 μL混合液滴加至换有新鲜培养液的6 孔板中，轻轻混匀，置培养箱中培养。

实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT - PCR）检测基因表达：组织中RNA 采用TRIzol（Invitrogen）法提取，用Fast200 试剂盒提取细胞中mRNA。逆转录酶试剂盒的反应条件为42 ℃、20 min 和85 ℃、5 min。SYBR Green试剂盒用于qRT-PCR，反应条件为预变性95 ℃、30 s，40个循环（95 ℃、5 s，57 ℃、45 s，72 ℃、45 s），72 ℃、60 s。GAPDH作为内参，使用2-ΔΔCt法计算相对定量。引物序列为AGTR1（Sense ATCCCAGAAAGTCGGCACCAGATG，Anti - sense TGACTTTGGCTACAAGCATTGTGCG）；GAPDH（Sense GAGCGAGATCCCTCCAAAAT，Anti -sense RGGCTGTTGTCATACTTCTCATGG）。

蛋白免疫印迹法检测细胞表达：收集细胞，离心（转速为3500 r/min）5 min，向细胞中加入300 μL M-PER后4 ℃冰浴30 min（期间每10 min振荡1次），离心（转速为12000 r/min）15 min，收集蛋白质。采用BCA 法测定蛋白质浓度，定量后上样，混匀，100 ℃加热5 min，冷却后上样10 μL（50 μg蛋白/泳道）。将胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，并在室温条件下用TBST封闭2 h，加入相应浓度的一抗，4 ℃孵育过夜；次日用TBST洗脱3次，每次15 min；加入二抗孵育1 h。加入显影检测试剂与膜蛋白充分混匀，室温孵育5 min，用凝胶成像仪曝光并拍照。

CCK-8法检测细胞增殖：收集细胞，以每孔100 μL（2× 103个细胞/孔）置96 孔板，每组重复6 个。将转染细胞分别培养指定时间后加入CCK-8试剂，置37 ℃孵育2 h，测量450 nm波长处的吸光度（OD）值。

克隆形成实验：将收集的细胞接种至50 mm 平皿中，接种单位为2000个细胞/皿，置培养箱中培养14 d，使用4%多聚甲醛溶液固定细胞15 min，再加入0.1%结晶紫液染色30 min，用清水清洗3 次，室温风干后拍照并计数。

Transwell 法检测细胞侵袭和迁移：用无血清的培养液将细胞置24 孔Transwell 板的上层小室中，将含有10%胎牛血清的培养基加入下层小室，设置3 个重复组，培养48 h 后取出上层小室，擦拭掉上层未穿过的细胞，用4%多聚甲醛溶液固定穿透细胞15 min，使用0.1%结晶紫染液染色30 min，使用倒置相差显微镜，随机选择5 个视野，计数被染成紫色的细胞数量。检测细胞迁移和侵袭时，分别使用不含Matrixgel 胶和含Matrixgel 胶的Transwell小室，其他操作步骤一致。

肿瘤模型构建：利用胰酶将过表达AGTR1的BEL-7404 肝癌细胞消化，使用磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞，置离心机中离心（转速的1000 r/ min）5 min，用PBS 重悬细胞2 × 106个/ 100 μL，用胰岛素针将细胞悬浮液注射入裸鼠的背部皮下。4 周后采用游标卡尺测量并记录肿瘤体积，肿瘤体积按公式V=1/2×L×W2计算。

免疫组化：将石蜡切片，脱蜡，复水，蒸馏水冲洗后置PBS 中浸泡5 min，抗原修复后使用3% H2O2孵育15～20 min，从而消除内源性过氧物酶活性。滴加封闭液，于室温下孵育15～20 min，添加适当稀释比例的一抗，于4 ℃孵育过夜。使用PBS 冲洗3 次，每次3 min，添加二抗覆盖组织，室温孵育50 min 后使用PBS 冲洗3 次，每次3 min，加入DAB 显色液，苏木素复染3 min，冲洗，脱水，透明，封片。

1.3 统计学处理

采用Graphpad 6.0统计学软件分析。采用单因素方差分析进行组间差异的显著性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC 中AGTR1 与VEGFA 表达的关系

374 例HCC 样本数据集中，AGTR1 和VEGFA 具有一定相关性（r= 0.27，P＜0.0001），详见图1 A。分析AGTR1表达的前80例（n=high 80）和后80例（n=low 80）样本与VEGFA的相关性，发现在AGTR1高表达（n=high 80）的样本中，AGTR1 与VEGFA 的相关性增强（r= 0.46，P＜0.0001），详见图1 B；在AGTR1低表达（n=low 80）的样本中，AGTR1 与VEGFA 无相关性（r=-0.00905，P=0.9365），详见图1 C。选择HCC 细胞系BEL-7404细胞转染AGTR1 和对照空载质粒，当AGTR1 表达量提高时，VEGFA 的蛋白水平显著上调（P＜0.001），详见图1 D和图1 E。

2.2 AGTR1 差异表达对BEL - 7404 细胞生长和体外转移的影响

细胞生长：采用CCK-8法考察BEL-7404细胞转染AGTR1 和对照空载质粒后细胞间活力的差异，结果BEL-7404 细胞组48 h 出现增殖差异（P＜0.05），随着时间的延长差异更明显（图2 A），提示过表达AGTR1的BEL-7404 细胞的增殖能力较其对照空载细胞明显增强。克隆形成实验用于检测BEL - 7404 细胞在过表达AGTR1和对照空载细胞的生长差异，发现过表达AGTR1的BEL-7404细胞的克隆形成能力较其对照空载细胞更强（图2 B）。

体外转移：采用Transwell 法检测AGTR1 差异表达的BEL - 7404 细胞在迁移和侵袭能力方面的差异，考察AGTR1差异表达对BEL-7404细胞转移能力的影响。结果表明，过表达AGTR1的BEL-7404细胞较其对照空载细胞的体外迁移和侵袭能力均显著增强（P＜0.001）。详见图2 C和图2 D。

2.3 抑制AGTR1 对VEGFA 表达的影响

HCC 数据集分析和实验结果均表明，AGTR1 与VEGFA的表达在HCC细胞中存在相关性，且AGTR1的过表达能促进BEL-7404细胞的增殖和迁移。使用AGTR1抑制剂洛沙坦，在转染前预先用50 μmol/ L 的洛沙坦处理细胞2 h，对BEL-7404细胞转染AGTR1和对照空载质粒48 h 后，采用蛋白免疫印迹法考察细胞在洛沙坦处理后AGTR1和VEGFA蛋白的表达情况。结果发现，洛沙坦能不同程度地抑制AGTR1过表达的BEL-7404细胞中AGTR1 和VEGFA 的表达（P＜0.01），对AGTR1低表达的BEL - 7404 细胞中VEGFA 的表达无影响（P＞0.05）。详见图3 A至图3 C。

2.4 抑制AGTR1 对肿瘤生长和血管形成的影响

采用过表达AGTR1 的BEL - 7404 细胞构建裸鼠皮下成瘤模型，成瘤1 周后，给予低、中、高剂量洛沙坦（20，40，80 mg / kg），4 周后测量肿瘤体积。结果显示，洛沙坦可以抑制肿瘤的生长，剂量为20 mg / kg时，具有不同程度的生长抑制作用（P＜0.05）。详见图3 D 和图3 E。

同样按上述处理方式，采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测成瘤裸鼠血清VEGFA 水平，发现不同处理组间血清VEGFA 水平出现不同程度的差异，当洛沙坦剂量增至40 mg/kg时，血清VEGFA水平显著下降（P＜0.05）。详见图3 F。为了进一步了解洛沙坦对肿瘤血管形成的影响，通过免疫组化法检测CD31阳性细胞水平，考察其对肿瘤血管形成的影响。与对照组比较，不同剂量的洛沙坦可不同程度地抑制肿瘤血管形成。详见图3 G。

3 讨论

血管生成的阻断一直被认为是抑制肿瘤生长的有效机制。目前，大多数获批的一线和二线晚期HCC 的治疗目标是血管生成途径［13］。VEGF/ VEGFRs 信号通路作为参与肿瘤血管生成的重要通路，已作为治疗HCC 的药物靶点［14-15］。VEGFA 是血管生成过程如内皮细胞增殖和迁移中最关键的配体［16-18］。因此，积极寻找有效的靶点抑制剂为肝癌患者的治疗指明了新的方向，通过确定并检测肿瘤标志物对有效诊断和治疗肝癌的重要性也不容忽视［19-20］。

LI等［21］的研究发现，服用ACEI可降低患癌风险，但部分学者在相关研究中并未得到类似结果。甚至有研究发现，ARB 的使用可能会增加患癌风险［22］。上述研究结果的差异可能与患者的种族、服药周期、数据处理方式等因素相关。结合本研究结果，洛沙坦在AGTR1过表达的患者中受益可能性更大，故应将患者个体的基因表达谱纳入是否服用ACEI/ARB的考虑因素。本研究中发现，AGTR1 与VEGFA 的表达具有一定相关性，且在高表达AGTR1 的患者中相关性更强，洛沙坦可以抑制AGTR1过表达引起的VEGFA 表达上调，均表明AGTR1 过表达在HCC细胞增殖、侵袭、血管形成等方面具有重要作用。

综上所述，AGTR1的过表达可促进HCC细胞的增殖、迁移和侵袭，其作用机制可能与增加VEGFA表达有关。洛沙坦作为靶向AGTR1 抑制剂，在一定程度上降低了VEGFA 的水平，可为ACEI 用于治疗AGTR1 高表达的HCC患者提供参考。