基于分子对接技术的安宫牛黄丸治疗新型冠状病毒肺炎作用机制研究*

郭 倩，宋延平，乔 园，马 力，赵林涛

（1. 陕西中医药大学，陕西 咸阳 712000； 2. 陕西省中医药研究院，陕西 西安 710000）

新型冠状病毒的Spike（S）蛋白包含S1 和S22个亚 基，其中S1 亚基与宿主细胞膜表面受体血管紧张素换酶2（ACE2）结合，由S2 亚基来促进靶细胞膜的融合，共同促进病毒感染，进而导致ACE2 水平降低［1-3］。ACE2主要表达于心脏、血管、肾脏、胃肠道及肺泡上皮细胞中，具有舒张血管、降低血管通透性、抗增殖、抗氧化应激、抗血栓、保护心血管的作用［4］，是新型冠状病毒肺炎（COVID-19）病理途径中的关键因子［5-6］。中医药历史悠久，在预防和治疗多种流行病中发挥了重要作用［7］。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版）——（七）中医治疗》中推荐COVID - 19 危重型患者服用安宫牛黄丸［8］。安宫牛黄丸由牛黄、水牛角浓缩粉、人工麝香、珍珠、朱砂、雄黄、黄连、黄芩、栀子、郁金、冰片等组方［9］，为中药清热开窍方“温病三宝”之首，素有“救急症于即时，挽垂危于顷刻”之美誉［10］。分子对接筛选技术是在现有生物结构的基础上发现新配体的技术，筛选过程极大地缩小了人工方法进行配体活性筛选的研究范围，并缩短了研究时间［11-12］。本研究中基于分子对接技术探讨了安宫牛黄丸中的有效化学成分与ACE2结合的亲和力及其治疗COVID - 19 的作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 数据库与软件

数据库：TCMSP 数据库（https：// old. tcmsp - e.com/tcmsp.php）；PDB数据库（https：//www.rcsb.org）。

软 件：AutoDock Tools 1.5.6（https：// autodock.scripps. edu）；AutoDock Vina 1.1.2（http：//vina. scripps.edu）；PyMOL 1.7（http：//pymol.org）。

1.2 有效化学成分筛选

采用TCMSP 数据库检索安宫牛黄丸中中药材的化学成分，剔除口服生物利用度（OB）低于30%和药物相似性（DL）低于0.18的成分。在TCMSP 数据库中下载成分的mol2 格式，将下载的成分导入ChemBioDraw Ultra 14.0 软件，转化为三维结构，并运行最低自由能。对于阅读文献补充的有效化学成分，采用ChemBioDraw Ultra 14.0软件绘制化合物的结构，并转化为三维结构，保存为mol2 格式，通过AutoDock Tools 1.5.6 软件将格式转换为pdbqt。珍珠、朱砂、雄黄主要含有金属和有害元素，不进行分子对接。其中，珍珠主要成分为碳酸钙及其他金属元素，朱砂主要含硫化汞，雄黄主要含砷。

1.3 作用靶点选择

从PDB 蛋白质数据库（https：//www.rcsb.org/）下载ACE2（PDB ID：1R4L）的晶体结构，采用PyMOL 1.7软件去除水分子及多余的氨基酸残基，挖掘ACE2 蛋白晶体复合结构中的原配体XX5（即相应靶蛋白的抑制剂，与靶蛋白的结合活性良好），将挖掘后的1R4L 命名为1R4L_s，并将1R4L_s 及XX5 保存为pdb 格式，导入AutoDock Tools 1.5.6软件，将格式转换为pdbqt。

1.4 分子对接模拟

将1R4L_s、XX5 及成分在AutoDock Tools 1.5.6 软件保存为pdbqt 格式，将XX5 原配体抑制剂的结合位置作为对接活性口袋。确定ACE2 活性位点的坐标为center_x = 40.199，center_y = 6.024，center_z = 29.006，size_x=15，size_y=15，size_z=15。除特别说明外，其他参数均采用默认值。选取对接结果打分值最高的构象，采用PyMOL 1.7 软件绘图。通过AutoDock Vina 1.1.2软件运算得到安宫牛黄丸中101种化学成分与ACE2蛋白的对接结果。

2 结果

2.1 有效化学成分筛选

采用TCMSP 数据库检索获得安宫牛黄丸中中药材化学成分共561 个，将OB ＜30%且DL ＜0.18 的成分剔除，得到有效化学成分88 个，文献补充13 个，最终纳入101个。

2.2 有效化学成分对接

结合能小于0，说明配体与受体可自发结合，选取结合能不超过-5 kcal/mol 的化学成分作为有效化学成分。由表1 可知，安宫牛黄丸中101 个有效化学成分与AEC2 的结合能均低于- 5 kcal/ mol，与ACE2 结合较好。其中，对接结合能排名前3 的有效化学成分分别为baicalin，corchoroside A_qt，sudan Ⅲ。其分子对接图见图1。

表1 安宫牛黄丸中有效化学成分与ACE2的结合能Tab.1 Binding energy of active chemical components in Angong Niuhuang Pills and ACE2

续表1 安宫牛黄丸中有效化学成分与ACE2的结合能Continued Tab.1 Binding energy of active chemical components in Angong Niuhuang Pills and ACE2

2.3 对接结果

安宫牛黄丸与ACE2 亲和力最好的3 个化学成分为黄芩中的baicalin（- 9.9 kcal/ mol）、黄连中的corchoroside A_qt（- 9.3 kcal / mol）、栀子中的sudan Ⅲ（-9.3 kcal/mol），上述3 个化学成分与XX5 的结合位点见表2，键合类型均为氢键。其中，baicalin，corchoroside A_qt，sudan Ⅲ在靶蛋白THR - 371 处以氢键的形式结合，baicalin与corchoroside A_qt在靶蛋白ASN-149处以氢键的形式结合。

表2 安宫牛黄丸中对接结合能排名前3的化学成分与XX5的结合位点对接结果Tab.2 Docking results of binding sites of XX5 and the chemical components which have the top three docking binding energy with ACE2 in Angong Niuhuang Pills

3 讨论

COVID-19属中医“瘟疫”范畴，命名为“肺瘟”［13-14］，在疾病的危重期邪乘虚而入［15］。中医具有整体观念、阴阳平衡、辨证施治等特点，在调养身体和增强对流行性疾病的抵抗力方面，具有独到见解和防治经验，其在COVID-19的治疗中发挥着重要作用［16］。

安宫牛黄丸主要功效为清热解毒、芳香开窍，使邪火随诸香一齐俱散。现代药理学研究表明，其具有抗炎、抗病毒、提高机体免疫力等作用［17-21］，临床常用于治疗温疫证属热入心包者。非典型性肺炎患者症状为邪胜正虚、内闭喘脱，用安宫牛黄丸联合其他药物治疗，临床疗效确切［22］。在COVID-19的治疗中，主要用于治疗危重型证属热入心包者。

由本研究结果可知，采用TCMSP数据库检索获得安宫牛黄丸中中药材的化学成分共561个，筛选OB ＜30%且DL ＜0.18 的成分，得到有效化学成分88 个，文献补充13个，最终纳入101个。通过与ACE2（PDB ID：1R4L）进行对接，筛选出亲和力最好的3 个成分为黄芩中的baicalin（- 9.9 kcal/ mol）、黄连中的corchoroside A_qt（-9.3 kcal/mol）、栀子中的sudanⅢ（-9.3 kcal/mol）。

ACE2属肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAS）［23］，参与多种肺部疾病（如炎症和纤维化）的调节，其正向调节途径过度激活，能导致炎性反应、组织纤维化、氧化应激、细胞增殖和凋亡、动脉粥样硬化等病理过程，造成多脏器损伤。Baicalin，corchoroside A_qt，sudan Ⅲ可能通过抑制RAS 的正向调节，起到抑制炎症及组织纤维化等作用，减少对肺等脏器的损伤。

一般情况下，ACE2 可催化血管紧张素（Ang）Ⅱ直接降解形成Ang-（1-7），AngⅠ可产生Ang-（1-9），在ACE的作用下产生有血管舒张作用的Ang-（1-7）。Ang-（1-7）可降低ACE 的活性，且对ACE2 的活性无影响；Ang-（1-7）显著提高了ACE2/ ACE 的活性比，可改善肺水肿和蛋白渗漏，减轻急性肺损伤；作用于Mas 受体，抑制RAS 的正向调控，从而发挥抑制炎性反应、抗增生、抗氧化应激等反向调节作用。严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）与宿主细胞受体ACE2结合，可触发SARS-CoV-2-ACE2复合物进入靶细胞，导致ACE2 下调及Ang Ⅱ/ Ang -（1 - 7）比例上升，从而导致肺功能恶化和肺部损伤。Baicalin，corchoroside A_qt，sudan Ⅲ等成分可能通过诱导ACE2及Ang-（1-7）上调，促使AngⅡ下调，使AngⅡ/Ang-（1 - 7）比例降低、ACE2/ ACE 比例升高，进而减轻SARS-CoV-2对肺部的损伤。

AngⅡ的上调对肺部的损伤，还表现为促炎性因子（如白细胞介素6、肿瘤坏死因子-α 等）的释放和免疫细胞的活化，诱导肺部炎性反应；可激活核苷酸氧化酶，大量作用于细胞膜的活性氧自由基被释放，导致肺水肿及肺损伤［24］。炎症与氧化应激相互作用，形成恶性循环［25］。Baicalin，corchoroside A_qt，sudan Ⅲ等成分可能通过抑制促炎因子表达而减轻炎性反应；也可能通过抑制核苷酸氧化酶的活性，使细胞膜脂质过氧化程度减轻，细胞膜通透性降低，从而使结构蛋白受损程度和胞内核酸反应程度减轻，最终导致肺部损伤减轻。黄芩中的活性成分baicalin具有抗炎、抗氧化、保护心肌缺血、免疫调节等药理学作用，临床可用于治疗肺炎、呼吸道感染等疾病［26］。其通过抑制核因子-κB 的转录表达、干预炎性反应（如抑制白细胞介素2、白细胞介素6、肿瘤坏死因子-α的表达）及细胞凋亡过程，增强ACE2蛋白的表达［27-28］。

脱精氨酸9 缓激肽（DABK）是一种肺部炎性因子，其末端残基可被ACE2 裂解，导致失活［29］。肺部ACE2活性的降低可导致DABK-B1受体轴的激活，气道上皮细胞释放促炎趋化因子，增加中性粒细胞浸润，加剧肺部的炎症和组织损伤［30-31］。SARS-CoV- 2 不仅具有致细胞病变效应和引起宿主的免疫病理反应，还阻断了肺保护通路。Baicalin，corchoroside A_qt，sudan Ⅲ等成分也可能通过抑制DABK-B1受体轴的激活，抑制中性粒细胞浸润，最终增强肺保护通路的作用。

治疗COVID-19的中药的化学成分中，关于baicalin的报道较多，corchoroside A_qt 和sudan Ⅲ几乎未见报道。但清开灵制剂及黄连解毒汤等中药复方中，黄连和栀子是2味重要的中药，corchoroside A_qt及sudan Ⅲ在黄连和栀子及相关复方中的作用还值得挖掘。基于上述研究结果，推测安宫牛黄丸与ACE2 蛋白结合活性较强，具有治疗COVID - 19 的潜力，可能通过黄芩中的baicalin、黄连中的corchoroside A_qt、栀子中的sudan Ⅲ促进ACE2 蛋白的表达及抑制RAS 的正向调节，导致Ang Ⅱ水平降低、Ang -（1 - 7）水平升高，起到舒张血管、减少血管及细胞膜的通透性、抗炎、抗氧化应激等作用。